簡介：血友病B是由于凝血因子IXFIX缺陷引起的X連鎖遺傳出血性疾病?；蛑委熓侵斡渥罾硐敕椒āＨ欢?，血友病B現(xiàn)有的基因治療途徑都是有創(chuàng)的。為了達(dá)到無創(chuàng)給藥的目的，我們?cè)O(shè)想以結(jié)腸上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過灌腸方法進(jìn)行血友病B的基因治療。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)RAAV2HFIX體外轉(zhuǎn)染腸上皮細(xì)胞能夠表達(dá)具有凝血活性的HFIX。為了進(jìn)一步探討通過灌腸給藥后RAAV2HFIX能否在體內(nèi)表達(dá)以及能否表達(dá)具有凝血活性的HFIX，本研究首先將RAAV2HFIX按110VGKG的劑量結(jié)腸灌注給正常昆明小鼠并分析HFIX的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，又從基因、蛋白等水平分析了結(jié)腸灌注RAAV2HFIX血友病B小鼠體內(nèi)HFIX的表達(dá)，HFIX的凝血活性以及出血表現(xiàn)的變化。實(shí)驗(yàn)顯示RAAV2HFIX結(jié)腸灌注正常昆明小鼠N16后第7天，血漿和腸液中均可以檢測到HFIX抗原，并在第21天達(dá)到高峰，第35天后基本消失。RAAV2HFIX結(jié)腸灌注血友病B小鼠后第21天，PCR擴(kuò)增結(jié)腸組織DNA及其產(chǎn)物DNA序列測定結(jié)果顯示，結(jié)腸組織中含有HFIX基因。免疫組化結(jié)果示HFIX基因表達(dá)的部位位于結(jié)腸粘膜組織。同時(shí)，結(jié)腸灌注RAAV2HFIX后第14天和第21天，在血友病B小鼠N4血漿中可檢測到HFIX抗原。第21天，結(jié)腸灌注RAAV2HFIX的血友病B小鼠血漿中HFIX的活性為2354±287％，APTT為851±17S，而結(jié)腸灌注生理鹽水的血友病B小鼠的HFIX活性為860±263％，APTT為926±23SN3。此外，割尾測定5MIN失血量結(jié)果顯示，結(jié)腸灌注RAAV2HFIX的血友病B小鼠的失血量減少。本研究證實(shí)灌腸途徑灌注RAAV2HFIX后血友癇B小鼠體內(nèi)可表達(dá)具有凝血活性的HFIX，表明結(jié)腸灌注無創(chuàng)給藥可能成為血友病B基因治療的新途徑。

簡介：流感病毒INFLUENZAVIRUS是一種能引起急性呼吸道疾病的病毒，具有高度傳染性，主要經(jīng)空氣飛沫傳播，因此它能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行。流行性感冒流感病毒在世界范圍內(nèi)引起人畜的發(fā)病和死亡。目前對(duì)流感的防治主要是接種流感疫苗。乙型流感病毒疫苗是其重要的組成部分。傳統(tǒng)制備疫苗的方法是使用雞胚生產(chǎn)，存在很多缺陷和局限性，應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗是個(gè)更好的選擇。VERO細(xì)胞是WHO積極推薦用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)。在乙型流感疫苗的研制中，乙型流感病毒感染很難適應(yīng)VERO細(xì)胞，并且很難得到持續(xù)的高產(chǎn)。在大量臨床樣本的基礎(chǔ)上，本論文成功篩選到一株乙型流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株，且能達(dá)到高產(chǎn)，穩(wěn)定的目的。將篩選到的毒株進(jìn)行一系列的抗原性分析和基因性分析，這些研究為VERO細(xì)胞乙型流感疫苗的開發(fā)提供前提。該毒株可以作為親本株，采用遺傳重配或反向遺傳學(xué)技術(shù)將其與流行毒株重配，制備VERO細(xì)胞乙型流感疫苗生產(chǎn)毒種。第一部分乙型流感病毒在VERO細(xì)胞上的適應(yīng)株的選育本實(shí)驗(yàn)在乙型流感病毒很難在VERO細(xì)胞上適應(yīng)的情況下，首先探索病毒的培養(yǎng)條件。確定病毒培養(yǎng)液中的TPCK胰酶終濃度1ΜGML，NAHCO3終濃度198ΜGML。和采用MEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基同時(shí)不添加谷氨酰胺等條件。在30株臨床樣本毒株中最終選育出一株乙型流感病毒VERO細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株，連續(xù)傳代21個(gè)代次，結(jié)果穩(wěn)定。同時(shí)進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)檢測。第二部分乙型流感病毒VERO細(xì)胞適應(yīng)株BYUNNAN022005B的基因分析本實(shí)驗(yàn)是在成功獲得一株乙型流感病毒VERO細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株的基礎(chǔ)上。重點(diǎn)對(duì)該毒株的基因性進(jìn)行研究。通過RTPCR的方法獲得該毒株的四個(gè)基因片段。通過對(duì)HA1，M，NA，NP進(jìn)行BLAST分析，認(rèn)識(shí)適應(yīng)株的基因背景。同時(shí)將HA1基因作為研究的重點(diǎn)，與國際流行株進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算出遺傳距離，構(gòu)建HA1基因進(jìn)化樹。將該毒株和WHO從2004年到2010年推薦疫苗株進(jìn)行比較和分析，找到氨基酸替換位點(diǎn)。

簡介：目的建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低，適于基層檢測孕婦血清中HSVDNA的方法，并初步評(píng)價(jià)該技術(shù)在臨床應(yīng)用價(jià)值。方法分別設(shè)計(jì)了HSVⅠ和HSVⅡ型特異的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONLAMP）引物，并利用該技術(shù)建立了快速檢測HSVDNA的反應(yīng)體系。并針對(duì)影響LAMP反應(yīng)的因素，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定了LAMP檢測HSVDNA的最佳反應(yīng)條件，初步鑒定了我們所建立方法的敏感性和特異性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)我們所收集的96例孕婦外周血標(biāo)本進(jìn)行了檢測，并與傳統(tǒng)的ELISA和熒光定量PCR做了比較。結(jié)果通過對(duì)LAMP檢測HSVDNA反應(yīng)體系的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫度是LAMP最大的影響因素，甜菜堿也是LAMP反應(yīng)能否進(jìn)行的關(guān)鍵因素，鎂離子等其他因素相對(duì)溫度和甜菜堿的影響較小。特異性鑒定結(jié)果表明僅單純皰疹病毒型特異性檢測為陽性，而對(duì)同屬的其他類型的皰疹及人類基因組DNA檢測均為陰性，酶切鑒定結(jié)果進(jìn)一步證明了擴(kuò)增的特異性。敏感性檢測下限為每反應(yīng)管（25ΜL的反應(yīng)體系）10個(gè)拷貝。對(duì)96例孕婦血清標(biāo)本分別進(jìn)行HSVⅠDNA和HSVⅡDNA檢測，HSVⅠ陽性例數(shù)為9例，HSVⅡ陽性例數(shù)為16例，并與ELISA和FQPCR檢測結(jié)果作比較。以FQPCR為檢測金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP與FQPCR陽性符合率大于94％，兩種方法差異不顯著（P001）；而ELISA與FQPCR相比，存在顯著性差異（P001）。結(jié)論實(shí)驗(yàn)表明LAMP技術(shù)用于HSVDNA檢測具有與FQPCR相近的特異性和敏感性，可靠性遠(yuǎn)高于目前普及的ELISA法。并且LAMP技術(shù)簡單快速、結(jié)果易判斷、成本低。如果進(jìn)一步優(yōu)化、完善和推廣，我們相信該技術(shù)將會(huì)在孕婦HSV感染的早期診斷和出生缺陷及傳染病的預(yù)防上發(fā)揮重要作用。

簡介：高危型人乳頭瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，HPV病毒感染被認(rèn)為是引起女性宮頸癌的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示98％的宮頸癌都是由人乳頭瘤病毒HPV感染引起，其中約70％是由HPV16或HPV18引起。因此，開發(fā)一種安全，有效的HPV18疫苗對(duì)于預(yù)防宮頸癌具有重大的意義。首先，本研究構(gòu)建了高效HPV18L1蛋白大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)。利用該表達(dá)系統(tǒng)，HPV18L1蛋白能夠以可溶性形式表達(dá)，保留了其天然的表位。其次，本研究還還針對(duì)大腸桿菌來源的HPV18L1蛋白建立了一套高效，易于放大的純化工藝，以及類病毒顆粒體外組裝工藝。根據(jù)該工藝所制備的HPV18VLPS疫苗純度達(dá)到98％以上，各項(xiàng)鑒定指標(biāo)均符合藥典要求。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，該疫苗具有高度的免疫原性，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體能能誘導(dǎo)高滴度的HPV18中和抗體。本研究在成功制備HPV18VLPS疫苗的基礎(chǔ)上，利用假病毒中和模型，一共鑒定出HPV18中和單抗6株，而后通過阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了優(yōu)勢中和單抗11A9以及3C3。為了進(jìn)一步闡明11A9單抗的中和機(jī)制，結(jié)合位點(diǎn)，在本研究對(duì)HPV18VLPS進(jìn)行了冷凍電鏡觀測，初步了解HPV18VLPS的結(jié)構(gòu)模式。此外，還進(jìn)一步制備了11A9HPV18VLPS抗原抗體復(fù)合物以備進(jìn)一步進(jìn)行冷凍電鏡研究?？傊狙芯坷么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備了一種廉價(jià)，有效的HPV18VLP疫苗，對(duì)HPV18的中和單抗進(jìn)行鑒定，并且對(duì)于HPV18優(yōu)勢單抗11A9的中和機(jī)制，結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了初步探索，為將來進(jìn)行HPV18疫苗的分子設(shè)計(jì)提供了參考。

簡介：第一部分大鼠反義細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2腺病毒載體的構(gòu)建目的正義基因反向克隆法構(gòu)建大鼠ANTIERK2腺病毒載體。方法酶切質(zhì)粒P3XFLAGCMV71ERK2，得到ERK2CDNA片段，連接到T載體進(jìn)行測序，經(jīng)測序正確反向克隆法插入質(zhì)粒PSHUTTLE中，最后轉(zhuǎn)入ADEASYTMXLADENOVIRALVECTSYSTEM系統(tǒng)中得到ANTIERK2基因腺病毒載體。結(jié)果DRAⅠ和NOTⅠ雙酶切鑒定ANTIERK2基因腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)插入的基因序列與插入方向均符合預(yù)期目標(biāo)。結(jié)論成功構(gòu)建了大鼠ANTIERK2腺病毒載體，為研究移植排斥中ERK2基因治療的作用提供了良好工具。第二部分腺病毒攜帶的反義細(xì)胞外信號(hào)激酶2基因治療對(duì)移植物血管和腎臟慢性排斥反應(yīng)損傷的保護(hù)作用目的探討反義細(xì)胞外信號(hào)激酶2基因治療對(duì)移植物血管和腎臟的慢性排斥反應(yīng)損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法選用血管移植BROWNNWAY→LEWIS和腎臟移植FISHER344→LEWIS二種慢性排斥反應(yīng)模型，移植前對(duì)同種血管移植物和腎臟移植物進(jìn)行體外ADANTIERK2基因轉(zhuǎn)染，分別于血管移植后60天和腎臟移植后90天分析慢性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)移植物的結(jié)構(gòu)和功能變化、目的基因和蛋白的表達(dá)以及免疫系統(tǒng)的相應(yīng)反應(yīng)。結(jié)果ADANTIERK2基因治療減少了移植物內(nèi)ERK目的基因蛋白的表達(dá)，緩解了慢性排斥反應(yīng)對(duì)同種血管移植物和腎臟移植物的損傷?？蛰d病毒加劇了同種血管及腎臟移植物的損傷。ADANTIERK2基因治療減少慢性排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)移植物內(nèi)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤并減少血清中TNFΑ及ICAM1的表達(dá)。結(jié)論ADANTIERK2基因治療對(duì)移植物血管及腎臟有保護(hù)作用，可以減緩慢性排斥反應(yīng)所造成的損傷。這種保護(hù)機(jī)制可能和減少移植物炎性細(xì)胞浸潤和減少免疫相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。

簡介：本研究分為三部分第一部分大鼠同種異體腎移植模型的建立目的建立一種穩(wěn)定、可靠、實(shí)用的大鼠同種異體腎移植急性排斥反應(yīng)模型。方法1采用移植腎置于左側(cè)，供腎原位低溫灌洗；移植腎帶主動(dòng)脈瓣與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合；供體左腎靜脈連其上方下腔靜脈斷端與受體下腔靜脈端側(cè)吻合；供體輸尿管帶膀胱瓣與受體膀胱吻合。2技術(shù)熟練后，行WISTAR→SD大鼠腎移植，隨機(jī)分為2組（每組12只）A組（排斥組），不作任何治療；B組（CSA治療組），術(shù)后使用CSA10D。兩組均行病理檢查和觀察生存期。結(jié)果1經(jīng)過3個(gè)月的練習(xí)，建立了比較穩(wěn)定的大鼠同種異體腎移植模型。手術(shù)成功率可達(dá)到90。2A組平均存活733D；B組平均存活212D。術(shù)后7天病理檢查示A組出現(xiàn)明顯的急性排斥反應(yīng)。結(jié)論此模型較容易掌握，除常規(guī)顯微外科器械外不需要特殊的器械或設(shè)備。第二部分?jǐn)y帶大鼠ICAM1基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建、體外鑒定與初步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建攜帶大鼠ICAM1RNA干擾的重組慢病毒。2篩選出基因抑制效率最高的重組慢病毒。3研究慢病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染主要臟器的有效性。方法1根據(jù)基因序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)4個(gè)靶點(diǎn)的寡核苷酸，制備雙鏈DNAOLIGO；HPAⅠ和XHOⅠ酶切PGCLGFP載體以使其線性化，將其與雙鏈DNAOLIGO在DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5Α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選獲得陽性克隆并進(jìn)行基因測序。2將重組載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，獲得的病毒顆粒經(jīng)濃縮后測定滴度。3通過重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染NRK細(xì)胞，以RTPCR和WESTERNBLOT法篩選出基因抑制效率最高的重組慢病毒，并將其再次擴(kuò)增、濃縮后測定滴度。4SD大鼠靜脈注射不同濃度重組慢病毒，分別于96小時(shí)、25天后檢測報(bào)告基因表達(dá)情況。結(jié)果1經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽性克隆基因測序結(jié)果完全正確。2獲得的針對(duì)4個(gè)靶點(diǎn)的重組慢病毒，經(jīng)RTPCR和WESTERNBLOT法證實(shí)，3病毒在MOI50時(shí)，基因抑制率即達(dá)到884。3大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，20108TU重組慢病毒可有效轉(zhuǎn)染各主要臟器，轉(zhuǎn)染25D后大鼠腎組織仍在不斷表達(dá)報(bào)告基因。結(jié)論1成功構(gòu)建了含有GFP報(bào)告基因的大鼠ICAM1RNA干擾慢病毒載體。2體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)NRK細(xì)胞，并能有效阻斷目的基因的表達(dá)。3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步確定了該慢病毒載體的有效性。第三部分慢病毒介導(dǎo)的ICAM1基因沉默治療大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng)目的1研究攜帶大鼠ICAM1RNA干擾的重組慢病毒抑制移植腎ICAM1基因表達(dá)的作用。2探討慢病毒介導(dǎo)的ICAM1基因沉默防治大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng)的作用效果和機(jī)理。3初步探討慢病毒載體結(jié)合RNA干擾應(yīng)用于同種異體移植排斥的效果和前景。方法1供體為WISTAR大鼠、受體為SD大鼠腎移植，隨機(jī)分為4組（每組12只）A組（同系對(duì)照組）；B組（排斥組），不作任何治療C組（空白對(duì)照病毒組）供體術(shù)前96小時(shí)尾靜脈輸注空白對(duì)照病毒20108TUD組（治療組）供體術(shù)前96小時(shí)尾靜脈輸注RICAM重組慢病毒20108TU。2腎移植術(shù)后觀察生存期，并抽取外周血，檢測腎功能，ELISA法檢測血清IL2、ICAM1的濃度。3腎移植術(shù)后7天取移植腎，RTPCR和WESTERNBLOT法檢測移植腎ICAM1的表達(dá)HE染色觀察病理變化。結(jié)果1腎移植術(shù)后治療組生存期達(dá)238天，與B、C兩組（僅為73、70天）相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2腎移植術(shù)后治療組血清CR、IL2、ICAM1的濃度與同系對(duì)照組相比無顯著差別，而與B、C兩組差別巨大。3腎移植術(shù)后7天，治療組移植腎ICAM1表達(dá)明顯被抑制。HE染色提示移植腎BANFF0～ⅠA級(jí)，而B、C組移植腎BANFFⅡBⅢA級(jí)。結(jié)論1攜帶ICAM1RNA干擾的重組慢病毒可以有效地、特異性地抑制移植腎ICAM基因的表達(dá)。2被植入經(jīng)RICAM重組慢病毒轉(zhuǎn)染的供腎后，受體的生存期明顯延長。3慢病毒介導(dǎo)的ICAM1基因沉默治療大鼠腎移植模型急性排斥反應(yīng)效果良好，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

簡介：大學(xué)生處于成長過渡階段戀愛并不十分穩(wěn)定分手的情況頻繁發(fā)生而每一次失戀都是成長中的一次重要事件對(duì)成長提出新的適應(yīng)和挑戰(zhàn)。在身心發(fā)展處于重要過渡階段的青年和成年早期對(duì)失戀之后的客觀認(rèn)識(shí)和正確引導(dǎo)是相當(dāng)重要的研究課題。綜上所述“失戀”問題是大部分人成長過程中所要經(jīng)歷的對(duì)此問題的探討是有一定現(xiàn)實(shí)意義的。本研究截取了完整感情經(jīng)歷的一個(gè)階段“失戀期”選取某高校學(xué)生共45名進(jìn)行研究失戀后被試會(huì)體驗(yàn)到負(fù)性情緒那么他們對(duì)失戀相關(guān)的刺激會(huì)有怎樣的認(rèn)知模式呢他們?cè)谡J(rèn)知的時(shí)間進(jìn)程上會(huì)表現(xiàn)出何種差異其原因又是什么本研究通過兩個(gè)研究探討失戀者對(duì)失戀刺激的認(rèn)知的時(shí)間進(jìn)程特征及原因研究一通過對(duì)失戀者認(rèn)知時(shí)間進(jìn)程的追蹤發(fā)現(xiàn)沒有任何實(shí)驗(yàn)處理的情況下他們的注意模式是定向偏向加速探測最初的注意回避總體的注意回避而在經(jīng)歷情緒誘發(fā)之后他們的注意模式是定向偏向加速探測最初的注意維持總體的注意回避并且他們與控制組在探測速度上表現(xiàn)出顯著差異說明他們對(duì)“失戀情緒刺激”有著不同于沒有經(jīng)歷的人的警覺和敏感。其原因通過研究二進(jìn)行了探索發(fā)現(xiàn)失戀組對(duì)戀愛相關(guān)事件的認(rèn)知和情緒混淆這一結(jié)果能夠解釋研究一失戀者失戀后記憶加工的長時(shí)特征中包含了認(rèn)知和情緒兩種成分他們對(duì)失戀事件的認(rèn)知信息和情緒信息有所混淆。因?yàn)檎J(rèn)知和情緒的混淆他們?cè)谡J(rèn)知的早期階段是完全受到自己失戀經(jīng)歷的影響的所以會(huì)表現(xiàn)出與控制組不同的反應(yīng)。這說明失戀者對(duì)失戀的記憶是存儲(chǔ)于情境獲得系統(tǒng)SAM中的他們經(jīng)歷了更多的情緒體驗(yàn)。

簡介：目的對(duì)野菊花抗HBV活性部位化學(xué)成分進(jìn)行分離及結(jié)構(gòu)鑒定，以期望發(fā)現(xiàn)新的抗HBV的活性單體。方法以HEPG2215細(xì)胞模型為體外篩選抗HBV活性的靶細(xì)胞模型，對(duì)野菊花提取物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。在活性指導(dǎo)下，采用硅膠柱層析，中、高壓制備柱，MCI，TOYOPEARL，ODS和SEPHADEXLH20等分離方法，對(duì)野菊花抗HBV活性部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，利用波譜學(xué)方法，鑒定分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果從野菊花抗HBV活性部位氯仿流分分離得到了32個(gè)化合物，通過1DNMR、2DNMR以及高分辨質(zhì)譜等波譜解析方法，鑒定了22個(gè)化合物，其中3個(gè)倍半萜二聚體CHRYSANTHEDIMERA1、野菊花內(nèi)酯（YEJUHUALACTONE3）、CHRYSANTHEDIMERB41個(gè)倍半萜三聚體CHRYSANTHETRIMER2；3個(gè)倍半萜CUMAMBRINA5、810二羥基3愈創(chuàng)木烯166內(nèi)酯DIHYDROCUMAMBRINB6、LEUKODIN7；4個(gè)三萜棕櫚酸16Β22Α二羥基假蒲公英甾醇16Β22ΑDIHYDROXYPSEUDOTARAXASTEROL3ΒOPALMITATE8、3Α21ΒDIHYDROXY11ΑMETHOXYURS12ENE9、HELIANTRIOLC10、16Β28DIHYDROXYLUPEOL3OSTEARATE11；1個(gè)甾醇胡蘿卜苷（DAUCOSTEROL，12）；2個(gè)生物堿ASPERPHENAMATE13、糙葉敗醬堿PATRISCABRATINE14）；2個(gè)聚乙炔類3S4S5R8SE8ACETOXY4HYDROXY3ISOVALEROYLOXY2HEXA24DIYNYLIDEN16DIOXASPIRO45DECANE15、LACTIFLODIYNEE16；6個(gè)黃酮金合歡素ACACETIN17、5羥基74二甲氧基黃酮5HYDROXY74DIMETHOXYFLAVONE18、5羥基7834四甲氧基黃酮5HYDROXY7834ETRAMETHOXYFLAVONE19、567三羥基345三甲氧基黃酮567TRIHYDROXYL345TRIMETHOXYFLAVONE20、木樨草素LUTEOLIN21、刺槐素7OΒD葡萄糖苷ACACETIN7OΒDGLUCOPYRANOSIDE22）?？笻BV活性初篩發(fā)現(xiàn)，野菊花的95％乙醇提物和50乙醇提取物具有較好的活性，其中95乙醇提取物的乙酸乙酯部位氯仿流份活性最好。結(jié)論本文以活性追蹤為指導(dǎo)，對(duì)野菊花的抗HBV活性部分進(jìn)行化學(xué)成分的研究，共分離得到32個(gè)化合物，鑒定了22個(gè)化合物，其中化合物1，2為新化合物，化合物4，9，13，14，16是首次從該屬植物中分離得到，化合物6，8，10，11為首次從該植物中分離得到。這些化合物的抗HBV活性，正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

簡介：類號(hào)R74905密級(jí)一般UDC6168917編號(hào)2009212182廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文強(qiáng)迫癥藥物合并認(rèn)知行為療法與單用藥物治療的隨機(jī)對(duì)照強(qiáng)迫癥藥物合并認(rèn)知行為療法與單用藥物治療的隨機(jī)對(duì)照研究及強(qiáng)迫癥與研究及強(qiáng)迫癥與SLC1A1基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究研究生研究生任建娟導(dǎo)師師唐牟尼教授申請(qǐng)學(xué)位類別申請(qǐng)學(xué)位類別醫(yī)學(xué)碩士年級(jí)年級(jí)二零零九級(jí)學(xué)科專業(yè)學(xué)科專業(yè)精神病與精神衛(wèi)生學(xué)研究方向研究方向臨床精神病學(xué)提交論文時(shí)間提交論文時(shí)間2012年5月論文答辯時(shí)間論文答辯時(shí)間2012年5月學(xué)位類型學(xué)位類型醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)位學(xué)位授予單位學(xué)位授予單位廣州醫(yī)學(xué)院答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)主席評(píng)議人評(píng)議人二零一二年五月目錄中文摘要1英文摘要5中英文對(duì)照8前言9對(duì)象與方法14結(jié)果20討論30全文結(jié)論36局限性37經(jīng)費(fèi)支持38參考文獻(xiàn)39綜述44攻讀學(xué)位期間的研究成果58致謝59學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明60學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)權(quán)屬聲明60關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明60

簡介：背景植入電子起搏器已成為治療癥狀性緩慢性心律失常的首選方法，并取得很大的成功。然而，有限的電池壽命、缺乏對(duì)神經(jīng)激素自動(dòng)反應(yīng)性、兒童期植入起搏器后電極不能隨身體的發(fā)育而相應(yīng)變長等缺點(diǎn)使得人們迫切需要一種更理想的治療方法。國內(nèi)外的學(xué)者研究認(rèn)為利用基因治療和細(xì)胞治療構(gòu)建生物起搏在不久的將來可能會(huì)成為電子起搏器最為理想的替代方法。然而目前有關(guān)生物起搏的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都沒有超過2周，這是否與目前研究者所選用的基因以及基因載體有關(guān)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)因其基因組可以整合于宿主基因組中，長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性，受到廣泛關(guān)注。所以本實(shí)驗(yàn)使用5AZA5氮胞苷誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)將HCN4超極化激活環(huán)核苷酸門控起搏基因使用慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察在體外能否構(gòu)建生物起搏細(xì)胞，并能長期表達(dá)，從而為進(jìn)一步在體研究生物起搏打下基礎(chǔ)。第一部分豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCS的分離、培養(yǎng)及5AZA誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的研究第一節(jié)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCS的分離、培養(yǎng)目的建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為5AZA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞提供材料。方法豬的骨髓MSCS分離純化后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。結(jié)果體外培養(yǎng)的原代MSCS10～14D達(dá)到融合，細(xì)胞周期顯示73％的細(xì)胞處于G0G1期。結(jié)論根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCS在體外條件下可生長擴(kuò)增，可用于5AZA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞。第二節(jié)5AZA體外誘導(dǎo)MSCS分化為心肌樣細(xì)胞的研究目的建立豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的方法，為構(gòu)建生物起搏細(xì)胞提供新材料。方法豬的骨髓MSCS分離純化后，用5AZA誘導(dǎo)后，用抗結(jié)蛋白DESMIN、肌球蛋白重鏈MHC、心肌特異性肌鈣蛋白ICTNI、連接蛋白43CX43進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。結(jié)果體外培養(yǎng)的第二代MSCS經(jīng)5AZA誘導(dǎo)后，部分MSCS呈梭形，陽性表達(dá)DESMIN、MHC、CTNI和CX43。結(jié)論根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCS在體外條件下可分化為心肌樣細(xì)胞，可用于構(gòu)建生物起搏細(xì)胞。第二部分穿梭質(zhì)粒PCDH1GFPHCN4的構(gòu)建及HCN4重組慢病毒的包裝第一節(jié)穿梭質(zhì)粒PCDH1GFPHCN4的構(gòu)建目的將全長約36KB的HHCN4目的基因片段從DRSTIEBER教授惠贈(zèng)的PCDNA3HHCN4質(zhì)粒卸載下來，最終裝載到帶有GFP綠色熒光蛋白標(biāo)記的去內(nèi)毒素穿梭質(zhì)粒PCDH1MCS1EF1COPGFP上。方法用ECORI和XBAI從PCDNA3HHCN4質(zhì)粒切下HHCN4目的片段連接到PUC19載體中，再用ECO砒和HINDIII從質(zhì)粒PUC19切下目的片段連接到PCDNA31A載體中，再用XBAI單酶從質(zhì)粒PCDNA31A雙切到PCDH1MCS1EF1COPGFP中。用XBAI或者ECORI鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒送上海生工測序，并將構(gòu)建的目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果XBAI及ECORI鑒定表明，PCR的產(chǎn)物和克隆擴(kuò)增的產(chǎn)物的電泳結(jié)果該基因的大小約為36KB；陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果與GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同；構(gòu)建的目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和原代的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，均發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的綠色熒光的出現(xiàn)。結(jié)論成功將全長HHCN4目的基因片段從PCDNA3HHCN4質(zhì)粒卸載下來，裝載到去內(nèi)毒素穿梭質(zhì)粒PCDH1MCS1EF1COPGFP上，可用于下一步慢病毒的包裝。第二節(jié)HCN4重組慢病毒的包裝目的使用慢病毒包裝系統(tǒng)PPACKH1LENTIVECTPACKAGINGKIT建立穩(wěn)定的HCN4重組慢病毒。方法實(shí)驗(yàn)過程參照SBI的LENTIVECTEXPRESSIONSYSTEM的操作手冊(cè)進(jìn)行。將構(gòu)建好的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾蟾腥?93T細(xì)胞及心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果構(gòu)建的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染293細(xì)胞和心肌樣豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，均發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的綠色熒光的出現(xiàn)，細(xì)胞感染效率可以達(dá)到90％以上。結(jié)論成功建立穩(wěn)定的HHCN4重組慢病毒，該病毒載體有很高的轉(zhuǎn)染效率。第三部分慢病毒轉(zhuǎn)染基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建起搏樣細(xì)胞的體外研究目的使用HHCN4重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞獲得穩(wěn)定過表達(dá)HCN4基因的起搏樣干細(xì)胞。方法慢病毒轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程參照SBI的LENTIVECTEXPRESSIONSYSTEM的操作手冊(cè)進(jìn)行；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周后行WESTERNBLOT鑒定蛋白的表達(dá)并行REALTIMERTPCR實(shí)時(shí)熒光定量檢測HCN4目的基因的表達(dá)情況；全細(xì)胞膜片鉗記錄轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCN4通道電流的表達(dá)；轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外長期培養(yǎng)觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染狀態(tài)。結(jié)果病毒感染48小時(shí)后，目的細(xì)胞出現(xiàn)大量的熒光；WESTERNBLOT檢測結(jié)果見圖，可見一約170KDA條帶，與克隆HHCN4通道蛋白分子量相符；RTPCR顯示慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞HHCN4RNA是原代細(xì)胞的123倍；膜片鉗記錄在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中可記錄到明顯的電壓與時(shí)間依賴性的超極化內(nèi)向電流，即IF電流；將轉(zhuǎn)染的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至2個(gè)月時(shí)，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈群體性搏動(dòng)，20℃室溫下的搏動(dòng)頻率為15±1次分。該病毒載體有很高的轉(zhuǎn)染效率，在體外已獲得至少8個(gè)月的陽性表達(dá)，8個(gè)月后因?yàn)榧?xì)胞污染未進(jìn)一步觀察。結(jié)論HHCN4重組慢病毒轉(zhuǎn)染心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞獲得了穩(wěn)定過表達(dá)HCN4基因的起搏樣干細(xì)胞。這種基因修飾后的心肌樣干細(xì)胞有可能成為一種有效的生物起搏種子細(xì)胞，并期待在緩慢性心律失常的治療技術(shù)上實(shí)現(xiàn)新突破。第四部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HHCN4起搏通道亞型的電生理特點(diǎn)目的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDH1GFPHCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，了解HHCN4起搏通道亞型的電生理特點(diǎn)。方法全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDH1GFPHCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察HHCN4通道電流、通道電流激活曲線及電壓依賴性激活時(shí)間常數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線；改變細(xì)胞外液K、NA濃度，觀察K、NA對(duì)IHHCN4電流的影響；以河豚毒素TTX，INA阻斷劑、四乙胺TEA，IK阻斷劑、環(huán)磷酸腺苷CAMP、異丙基腎上腺素ISO、乙酰膽堿ACH、銫CS、ZD7288IF電流特異性阻斷劑和胺碘酮分別灌流，觀察它們對(duì)IHHCN4電流的影響。結(jié)果1大多數(shù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的心肌樣骨髓干細(xì)胞可記錄到約80MV開始激活的一系列超極化內(nèi)向離子流IHHCN4電流，該電流激活緩慢，呈電壓、時(shí)間依賴性。電流的激活電位VTH、半最大激活電位V12分別為83±8MV、108±2MV，斜率為112±06MVN10。鉗制電壓140MV時(shí)，激活時(shí)間常數(shù)為066±01S鉗制電壓110MV時(shí)，激活時(shí)間常數(shù)為31±07S。IHHCN4的反轉(zhuǎn)電位212±23MVN10，PNAPK為023。2鉗制電位140MV，外液K濃度30MMOLL，NA濃度由110MMOLL降為50MMOLL，IHHCN4電流密度分別為300±25PAPF1、87±10PAPF1，減少73％；外液NA濃度110MMOLL，K濃度由30MMOLL降為5MMOLL，IHHCN4電流密度分別為302±30PAPF1、244±19PAPF1，減少20％。3TTX和TEA灌流10MIN，對(duì)IHHCN4沒有影響。41MMOLLCAMP灌流10MIN，IHHCN4無明顯變化，電極內(nèi)液中加入終濃度為1MMOLL的CAMP，IHHCN4激活加快，激活時(shí)間加快，V12由109±2MV變?yōu)?2±2MV，向正向移動(dòng)17MV，激活閾值及最大激活電流沒有明顯改變51ΜMOLLISO灌流10MIN，IHHCN4略加快。1ΜMOLLACH灌流10MIN，IHHCN4無明顯改變。6低濃度CS可阻滯IHHCN4，沖洗后抑制作用完全恢復(fù)，半效抑制濃度IC50為1288±281ΜMOLL；較低濃度ZD7288可阻滯IHHCN4，沖洗后抑制作用不能恢復(fù)，IC50為238±57ΜMOLL。7胺碘酮可阻滯IHHCN4，沖洗后抑制作用無明顯恢復(fù)，IC50為134±033ΜMOLL；胺碘酮使各鉗制電壓下IHHCN4激活緩慢。結(jié)論重組HCN4慢病毒轉(zhuǎn)染心肌樣干細(xì)胞，其表達(dá)的IHHCN4電流具有天然IF電流特點(diǎn)，表現(xiàn)為電壓與時(shí)間依賴性的超極化內(nèi)向電流、CAMP直接激活、NAK離子混合通透，CS、ZD7288可以阻斷IHHCN4；胺碘酮可以抑制IHHCN4，這些不僅為起搏通道HCN4基因治療緩慢性心律失常提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為胺碘酮治療由于起搏電流異常增加所致的快速型心律失常提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡介：內(nèi)蒙古師范大學(xué)碩士學(xué)位論文基于對(duì)目的語文化認(rèn)知基礎(chǔ)之上的英語學(xué)習(xí)心理研究姓名常云申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)發(fā)展與教育心理學(xué)指導(dǎo)教師陳中永199961解決英語學(xué)習(xí)閩題。國外對(duì)第二語言學(xué)習(xí)的研究進(jìn)行得眈較早，成果也較多。我匿在這方西的簪究起步晚，成果也較少。就我國旦翦的情況來看，還大多處在研究、驗(yàn)證圈外已有理論、照搬別人邑有研究成果的水平。這種理論上的先天不足，又導(dǎo)致我們?cè)诮虒W(xué)方法上一陣風(fēng)、一陣惑。忽囂偏重語法、忽而偏重交際。而且在應(yīng)試教育的指揮棒下，英語學(xué)蜀已變成了永遠(yuǎn)也背不完的單溺、永遠(yuǎn)也傲不完的練習(xí)題及永遠(yuǎn)也無法靈活運(yùn)用的語法規(guī)則。應(yīng)試教育極端的分?jǐn)?shù)論已經(jīng)徹底地使英語學(xué)習(xí)走進(jìn)了死胡瘸?；柽@種理論與實(shí)踐的現(xiàn)狀，我魍提出了“文化認(rèn)知模式”的英語學(xué)習(xí)理論。“文化認(rèn)知摸式”英語學(xué)習(xí)理論的提毖，既是對(duì)已有理論的充分概括和歸納總結(jié)，同時(shí)也是針對(duì)我國英語教育、教學(xué)實(shí)踐，對(duì)英語學(xué)習(xí)的有益探索，它強(qiáng)調(diào)文化因索在英語學(xué)習(xí)中的重要性，強(qiáng)調(diào)言語學(xué)習(xí)過程不僅羆一個(gè)不斷吸收語畜基本知識(shí)，而且應(yīng)該是不斷攝入語言文化背景知識(shí)，使學(xué)瀉者對(duì)他民族文化認(rèn)知結(jié)構(gòu)不斷建構(gòu)與發(fā)展的過程，從而為準(zhǔn)確、無誤地進(jìn)行言語交際活動(dòng)提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使學(xué)習(xí)者最終熊夠囊正發(fā)展起另一套語言執(zhí)制?！拔幕J(rèn)知模式”以語言與文化密不可分的關(guān)系為切入點(diǎn)展開全文。一方瑟，語言是人類文化的重要組成部分，是人類文化褥以建構(gòu)和僚承的形式和手段。另一方面，文化又無時(shí)無刻地不對(duì)語言有制約作用和決定性的影響。所以，言語學(xué)習(xí)是絕對(duì)不熊拋棄對(duì)語言文字背后的文化的認(rèn)知，對(duì)他民族文化的感應(yīng)與認(rèn)知將是準(zhǔn)確駕馭一門語言、_||爨利進(jìn)行交際活動(dòng)的前提與關(guān)鍵所在。文化認(rèn)翔是搭瀲語言為媒介，學(xué)習(xí)者不斷接受、認(rèn)識(shí)、了解目的語文化的心理過程，燕學(xué)習(xí)者的他民族的文化認(rèn)翔結(jié)構(gòu)不斷建構(gòu)、發(fā)展的過程?！拔幕J(rèn)翔模式”從心理學(xué)的角度重新分析、鰓釋了言語學(xué)習(xí)的心理過程?！延械睦碚撜J(rèn)為，言語學(xué)習(xí)過程是出語言信怠的輸入，翔感知語言材料、記憶語言知識(shí)點(diǎn)，最終產(chǎn)生言語的過程。麗“文化認(rèn)知模式”強(qiáng)調(diào)語富知識(shí)的習(xí)得與掌握不僅僅是單維的信惠習(xí)得、存儲(chǔ)、提取和利用過程，麗是強(qiáng)2‘

簡介：乙型肝炎病毒HBV感染的治療藥物研究雖然已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但如何完全阻斷HBV在體內(nèi)的復(fù)制一直是生物醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)?？笻BV藥物已成為當(dāng)今全球抗病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，LA蛋白LA具有穩(wěn)定HBVRNA，使其免受核酸酶破壞的作用，引起相關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注。LA與HBV之間的相互作用研究有許多亟待解決的問題，相關(guān)機(jī)制的深入探索將為抗HBV藥物研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和途徑。本課題分別在體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)HBV肝癌細(xì)胞中，擬通過研究LA及突變體對(duì)ADR亞型HBVRNA的結(jié)合親和力分析、HBV及F體外轉(zhuǎn)錄翻譯的影響，以及細(xì)胞內(nèi)LA與HBV復(fù)制的關(guān)系，探討LA及其突變對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄、翻譯啟動(dòng)、HBVRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)表達(dá)和病毒復(fù)制的影響，并期望通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)影響HBV復(fù)制的關(guān)鍵因素，尋找阻斷HBV復(fù)制的新的干預(yù)方法，為乙型肝炎病毒的防治提供新的策略。研究分為以下三個(gè)部分進(jìn)行。第一部分人LA蛋白及其突變體原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)純化本實(shí)驗(yàn)采用定點(diǎn)突變和PCR技術(shù)，完成點(diǎn)突變和大片段缺失突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，獲得HLA三個(gè)突變體DEL1，DEL2，DEL3真核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中融合表達(dá)，經(jīng)親和層析和HPLC純化，實(shí)現(xiàn)了野生型HLA及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，為后期實(shí)驗(yàn)研究打下了關(guān)鍵基礎(chǔ)。1突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建野生型HLA表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證后，利用PFUULTRAHIGHFIDELITYDNAPOLYMERASE完成點(diǎn)突變；合理設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)，進(jìn)行片段缺失突變。測序結(jié)果表明，HLA突變體表達(dá)質(zhì)粒的序列正確，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。2野生型HLA及其突變體表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將經(jīng)測序分析正確的野生型HLA和突變體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3和ROSETTA2，分別誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出表達(dá)量高的菌種。以50MMOLLNA2HPO4NAH2PO4，05MOLLNACLPH801G菌體20ML懸浮菌體，超聲破碎，收集上清液。經(jīng)HIS親和柱層析純化后的樣品調(diào)整PH為55，進(jìn)行離子交換層析純化，以20MMOLLNA2HPO4NAH2PO4PH55的緩沖液對(duì)其進(jìn)行脫鹽，更換緩沖體系，HPLC進(jìn)一步純化，收集洗脫峰。蛋白濃度分別為HLA08MGML、DEL107MGML、DEL206MGML、DEL305MGML。第二部分體外系統(tǒng)中HLA及其突變體對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響HBV的DNA、RNA等調(diào)節(jié)基因區(qū)都有肝細(xì)胞蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。肝細(xì)胞蛋白與這些調(diào)節(jié)基因之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)HBV的轉(zhuǎn)錄與基因表達(dá)。HLA作為肝臟核提取物的成分之一，對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用尚無明確定位。本部分研究采用電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)和體外轉(zhuǎn)錄翻譯體系，研究HLA及其突變體對(duì)HBVRNA的遷移率、HBV及F體外轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響。1HLA及其突變體與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合性分析根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)測的結(jié)果，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得HBV莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA，采用EMSA比較HLA及突變體與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的電泳遷移率，分析HLA的位點(diǎn)突變對(duì)結(jié)合HBVRNA產(chǎn)生的影響。EMSA的結(jié)果表明，野生型HLA與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的親和力最高；DEL1和DEL3的結(jié)合力下降；DEL2幾乎無結(jié)合能力。提示，HLA的位點(diǎn)突變不同程度的影響了其與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的親和力，影響的程度與突變位點(diǎn)密切相關(guān)。2HLA及其突變體對(duì)HBVRNAS體外轉(zhuǎn)錄的影響構(gòu)建ADR亞型HBV全基因和4個(gè)FPCMVTNTP、PCMVTNT全S、PCMVTNT全C、PCMVTNTX真核表達(dá)質(zhì)粒；以線性DNA為模板，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，將HLA及其突變體分別加入各體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，比較體外轉(zhuǎn)錄的RNA的完整性和產(chǎn)量，分析HLA及其突變對(duì)HBVRNAS體外轉(zhuǎn)錄的影響。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，HLA上調(diào)了HBV全基因和P基因的轉(zhuǎn)錄P＜005，而在全C基因和X基因的轉(zhuǎn)錄中分別出現(xiàn)了顯著的促進(jìn)和抑制作用。DEL1和DEL3對(duì)HBV及其F的作用未出現(xiàn)明顯的上調(diào)和抑制作用，DEL2對(duì)HBV全基因和P基因轉(zhuǎn)錄有較弱的下調(diào)作用，但顯著抑制了X基因的轉(zhuǎn)錄P＜001，推測HLA的RRM3可能與X基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。提示HLA對(duì)HBV全基因及其F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的活性差異可能由各FRNA的空間結(jié)構(gòu)的差異所致，也與HLA和HBVRNA的作用部位有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，HBV全基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)于各F的轉(zhuǎn)錄，推測完整的HBV基因組中也可能含有某些活性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。3HLA及其突變體對(duì)HBV蛋白表達(dá)的影響以“實(shí)驗(yàn)二”中構(gòu)建的體外轉(zhuǎn)錄翻譯的真核表達(dá)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，將HLA及其突變體分別加至熒光標(biāo)記的體外翻譯系統(tǒng)中，探討HLA及其突變體等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對(duì)HBV蛋白翻譯啟動(dòng)和病毒復(fù)制的影響。表達(dá)產(chǎn)物分別經(jīng)SDSPAGE電泳后，采用TYPHOON9400熒光掃描儀檢測結(jié)果；常規(guī)轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測HBSAG和HBEAG的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入HLA后HBSAG表達(dá)量明顯上升P＜005，DEL1對(duì)HBSAG的表達(dá)量也有上調(diào)作用P＜005，而DEL2和DEL3的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。全長HBV表達(dá)HBEAG的量遠(yuǎn)高于C基因的表達(dá)量。此外，HLA明顯下調(diào)了C基因的表達(dá)，而DEL2和DEL3顯著上調(diào)C基因的表達(dá)，表明DEL2和DEL3中缺失的肽段RRM3和RRM2很可能對(duì)全C基因的體外表達(dá)有抑制作用。提示，HLA的不同部位或肽段可能對(duì)HBVRNA的作用效應(yīng)不同。第三部分HEPG2215細(xì)胞中LA對(duì)HBV復(fù)制和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響1SIRNA的合成與轉(zhuǎn)染針對(duì)HLAMRNA序列設(shè)計(jì)特異性SIRNA，體外轉(zhuǎn)錄合成4條LA特異性SIRNA，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HBV的HEPG2215細(xì)胞，電化學(xué)發(fā)光檢測HEPG2215細(xì)胞分泌HBSAG和HBEAG含量變化。結(jié)果表明，HBSAG和HBEAG含量在轉(zhuǎn)染前3天呈逐漸下降趨勢，而從轉(zhuǎn)染第5天起，隨著RNA干擾效率的降低，HBSAG和HBEAG含量也隨之升高。提示，細(xì)胞內(nèi)LA與HBV蛋白表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。2細(xì)胞內(nèi)LA蛋白與HBV蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的關(guān)系SIRNA干擾HEPG2215細(xì)胞中LA的表達(dá)，熒光定量PCR檢測LAMRNA含量，分析特異性SIRNA對(duì)LAMRNA的干擾活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBVDNA含量變化，分析LA與HBV蛋白質(zhì)表達(dá)及病毒復(fù)制的相關(guān)性。結(jié)果顯示LA特異性SIRNA降低了HEPG2215細(xì)胞中LAMRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后第3天，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染SIRNA1的細(xì)胞分泌HBSAG下降376％，轉(zhuǎn)染SIRNA2的下降239％，轉(zhuǎn)染SIRNA3的下降383％；細(xì)胞分泌HBEAG分別下降494％，304％和56％；HBVDNA分別下降329％，189％和356％。SIRNA3的干擾效率最好。對(duì)LAMRNA含量變化水平與HBSAG，HBEAG和HBVDNA的表達(dá)水平變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，HBSAG、HBEAG和HBVDNA變化水平與LAMRNA變化水平的相關(guān)系數(shù)分別為09382，08994，07949。表明HBSAG、HBEAG和HBVDNA的含量變化水平和LAMRNA含量變化水平呈正相關(guān)。提示在細(xì)胞水平上，LA與HBV蛋白表達(dá)和復(fù)制有密切關(guān)聯(lián)。結(jié)論1本課題針對(duì)HLA及突變體與ADR亞型HBVRNA的結(jié)合作用進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLA與HBVRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)有親和結(jié)合關(guān)系，DEL1和DEL3的結(jié)合作用減弱，而DEL2顯著降低了結(jié)合親和力。提示，HLA的缺失突變影響其與HBVRNA的結(jié)合，影響程度與突變部位相關(guān)，RRM3可能是HLA發(fā)揮結(jié)合作用的功能域。2體外轉(zhuǎn)錄研究表明HLA上調(diào)HBV全基因和P基因的轉(zhuǎn)錄P＜001，對(duì)全C基因和X基因的轉(zhuǎn)錄分別出現(xiàn)顯著的促進(jìn)和抑制作用；DEL2和DEL3對(duì)HBV全基因轉(zhuǎn)錄有較弱抑制作用P值分別為0017和003；HLA及突變體在全S基因轉(zhuǎn)錄中未見顯著性作用，但下調(diào)了X基因轉(zhuǎn)錄，且DEL2的抑制作用最強(qiáng)。推測HLA的RRM3與X基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。提示，HLA對(duì)HBV全基因及其F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的活性有差異，可能與各FRNA的不同空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。3體外翻譯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HLA促進(jìn)HBSAG表達(dá)、抑制HBEAG表達(dá)；DEL2和DEL3明顯促進(jìn)HBEAG表達(dá)。表明DEL2和DEL3中缺失的肽段可能對(duì)C基因的體外表達(dá)有抑制作用。提示，HLA的不同部位或肽段對(duì)HBVRNA的調(diào)控效應(yīng)不同。4在細(xì)胞水平上，探討LA與HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明LA特異性SIRNA降低了HEPG2215細(xì)胞中LAMRNA的表達(dá)；HBSAG、HBEAG和HBVDNA的含量隨LAMRNA含量降低而減少。說明在HEPG2215細(xì)胞內(nèi)，HLA與HBV的復(fù)制和蛋白表達(dá)有密切聯(lián)系。5本課題分別在體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)和穩(wěn)定表達(dá)HBV肝癌細(xì)胞中，研究LA對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明HLA與HBVRNA有結(jié)合關(guān)系，HLA突變影響結(jié)合親和力，HLA和突變體的空間結(jié)構(gòu)及HBVRNA的構(gòu)象均不同程度影響HBV轉(zhuǎn)錄和翻譯，RRM3和RRM2都是重要的調(diào)控元件。

簡介：分類號(hào)密級(jí)國際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文乙型肝炎病毒X蛋白通過上調(diào)CAPN4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的研究（題名和副題名）張峰（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名馮英明教授（主任醫(yī)師）指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱腫瘤學(xué)論文提交日期201004答辯日期201005論文起止時(shí)間2008年8月至2010年4月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄縮略語表縮略語表1中文摘要中文摘要3英文摘要英文摘要6前言9文獻(xiàn)回顧文獻(xiàn)回顧10正文19乙型肝炎病毒X蛋白通過上調(diào)CAPN4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的研究191材料192方法233結(jié)果424討論57結(jié)論61參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)62個(gè)人簡歷和研究成果個(gè)人簡歷和研究成果68致謝69

簡介：目的觀察病毒性腦炎顱腦核磁共振MRI掃描的表現(xiàn)特點(diǎn)比較磁敏感加權(quán)成像技術(shù)SUSCEPTIBILITYWEIGHTEDIMAGINGSWI與常規(guī)MRI序列在顯示病毒性腦炎病灶內(nèi)出血方面的差異探討磁敏感加權(quán)成像技術(shù)SUSCEPTIBILITYWEIGHTEDIMAGINGSWI在病毒性腦炎病情評(píng)價(jià)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法臨床診斷為病毒性腦炎的患者29例男16例女13例年齡7個(gè)月59歲平均年齡132歲。發(fā)病時(shí)間均在15天以內(nèi)均伴有明顯不同嚴(yán)重程度臨床癥狀常規(guī)MRI掃描可見不同嚴(yán)重程度影像表現(xiàn)。根據(jù)格拉斯哥昏迷評(píng)分GCS將患者分為輕度癥狀≥13分中度癥狀912分、重度癥狀38分三組。根據(jù)MRI常規(guī)序列表現(xiàn)進(jìn)行影像分級(jí)輕度I級(jí)單側(cè)幕上1處斑片狀病灶中度Ⅱ級(jí)雙側(cè)幕上對(duì)稱性、非對(duì)稱性病變重度Ⅲ級(jí)顱內(nèi)3處以上病變累及多個(gè)腦葉及或累及腦干、小腦。應(yīng)用GESIGNAEXCITEHD30T超導(dǎo)型磁共振掃描儀采用頭部8通道線圈。對(duì)所有病例行常規(guī)MRI序列及SWI序列掃描。常規(guī)MRI序列包括橫斷T1加權(quán)流動(dòng)衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列T1WEIGHTEDFLUIDATTENUATEDINVERSIONRECOVERYSEQUENCET1FLAIRTR2675MSTE23MSTI860MS、快速自旋回波FSET2WITR4600MSTE110MS、流動(dòng)衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列FLAIRTR9602MSTE117MSTI2400MS及矢狀位快速自旋回波FSET2WITR4600MSTE110MS層厚5MM層間距15MM。DWITR6000MS、TE82MS、B01000SMM2層厚5MM層間距15MM。SMI掃描采用以下參數(shù)TR32MSTE20MSFA15°層厚20MM矩陣320384FOV240MM240MM掃描時(shí)盡量避開顱底顳骨巖部、副鼻竇及乳突等含氣部位。掃描完成后通過磁共振機(jī)器SWI后處理軟件自動(dòng)得到校正后的磁矩圖與相位圖應(yīng)用ADW43工作站3DMIP軟件對(duì)校正后的磁矩圖進(jìn)行最小密度投影得到軸位MINIP圖SWIMINIP。相關(guān)參數(shù)與軸位常規(guī)MRI序列相同。2位影像學(xué)醫(yī)師獨(dú)立對(duì)29例病例進(jìn)行影像描述、診斷并采用ADW43工作站REFMAT軟件3DROOLS選項(xiàng)測量常規(guī)軸位MRI序列和軸位MINIP圖病變內(nèi)出血的體積結(jié)果以平均值顯示。應(yīng)用SPASS160統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用WILCOXON法將T1WI、T2WI、FLAIR與SWI所測得的出血數(shù)分別進(jìn)行對(duì)比分析不同影像嚴(yán)重程度3組及不同癥狀嚴(yán)重程度的3組SWI所得數(shù)據(jù)則采用成組設(shè)計(jì)多樣本比較秩和檢驗(yàn)KW檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。取P＜005表示存在差異P＜001表示存在顯著差異。結(jié)果29例患者中常規(guī)MRI發(fā)現(xiàn)10例患者單發(fā)19例患者為多發(fā)。單發(fā)病變分為彌漫性病變與局限性病變2種多發(fā)病變分為對(duì)稱性病變與散發(fā)性病變2種對(duì)稱性病變多表現(xiàn)為雙側(cè)腦干、雙側(cè)基底節(jié)區(qū)對(duì)稱性病變散發(fā)性病變表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)大腦及小腦半球散發(fā)病變。病變可單獨(dú)侵犯腦灰質(zhì)及白質(zhì)亦可灰、白質(zhì)同時(shí)受累。25例患者常規(guī)MRI表現(xiàn)為斑片狀等或長T1、長T2異常信號(hào)27例患者FLAIR呈高信號(hào)。DWI示3例病毒性腦炎患者發(fā)病23天常規(guī)MRI序列T1WI、T2WI、T2FLAIR無明顯信號(hào)改變DWIB1000可見明顯高信號(hào)ADC值降低20例病毒性腦炎患者發(fā)病210天T1WI呈等低信號(hào)T2WI及T2FLAIR呈高信號(hào)DWIB1000呈明顯高信號(hào)ADC值降低提示病變?cè)缙诓《拘阅X炎腦水腫以細(xì)胞毒性水腫為主。6例患者發(fā)病14天后T1WI呈低信號(hào)T2WI及T2FLAIR序列呈高信號(hào)DWIB1000呈等或略低信號(hào)ADC值升高提示晚期病毒性腦炎腦水腫為血管源性水腫。常規(guī)MRIF序列T1FLAIRFST2WIT2FLAIR顯示病毒性腦炎病灶內(nèi)出血平均體積分別為007±017CM3、012±022CM3、014±024CM3SWI序列為106±165CM3應(yīng)用WILCOXON法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)示T1WI、T2WI及T2FLAIR與SWI比較P值均小于005SWI在顯示病毒性腦炎病變內(nèi)出血方面較常規(guī)序列具有明顯優(yōu)越性。SWI顯示不同MRI嚴(yán)重程度輕、重、中度病毒性腦炎病灶內(nèi)出血平均體積分別為009±029CM3、056±088CM3、298±193CM3成組設(shè)計(jì)多樣本比較秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示P＜001接受SWI所顯示的病毒性腦炎不同影像嚴(yán)重程度組間出血量存在顯著差異。SWI顯示不同嚴(yán)重程度臨床輕、中、重度病毒性腦炎病灶內(nèi)出血平均體積分別為008±027CM3、087±081CM3、306±023CM3成組設(shè)計(jì)多樣本比較秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示P＜001接受SWI所顯示的病毒性腦炎臨床癥狀不同嚴(yán)重程度組間出血量存在顯著差異。結(jié)論MRI是診斷病毒性腦炎的重要輔助檢查方法SWI序列可以清楚的顯示病毒性腦炎病變內(nèi)的出血有助于對(duì)病毒性腦炎的病情進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估進(jìn)而為治療提供幫助。

簡介：分類號(hào)密級(jí)國際十進(jìn)分類號(hào)（UDC）第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)位論文腹腔注射LPS對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及腹腔注射LPS對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及HO1和INOS在其中的作用在其中的作用（題名和副題名）信玉昌（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名孫緒德副教授副主任醫(yī)師指導(dǎo)教師單位第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)名稱麻醉學(xué)論文提交日期200905答辯日期200905論文起止時(shí)間2007年10月至2009年5月學(xué)位授予單位第四軍醫(yī)大學(xué)腹腔注射腹腔注射LPS對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及HO1和INOS在其中的作用在其中的作用研究生信玉昌學(xué)科專業(yè)麻醉學(xué)所在單位第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院麻醉科導(dǎo)師孫緒德副教授（副主任醫(yī)師）輔導(dǎo)老師侯立朝副教授（副主任醫(yī)師）關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞大鼠；認(rèn)知功能障礙；脂多糖；血紅素加氧酶1；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)2009年05月