刺梨(Rosa roxburghii Tratt)抗白粉病的分子機制.pdf

1、刺梨(Rosa roxburghii Tratt)屬薔薇科薔薇屬植物。其果實肉脆、甜酸、具濃郁的特殊香味,被譽為水果中的“Vc之王”。其防癌、抑癌和抗衰老等保健作用在國內外引起很大關注。但在人工栽培過程中,白粉病發(fā)生較為普遍,主要危害幼葉、花蕾和幼果,在溫暖濕潤的地方或季節(jié)為害更為嚴重。培育抗病優(yōu)質品種成了果樹育種重要的方面之一,其前提是對抗病機制有較好的理解并應用。本研究選用抗、感白粉病品種為材料,從群體生物學、細胞學、分子生物學以及

2、病理學等角度,開展了刺梨抗白粉病分子機制相關工作。主要結果如下:
　　 1.從病理學角度研究了刺梨白粉病年發(fā)生規(guī)律和白粉菌形態(tài)結構,包括分生孢子梗的熒光觀察；分生孢子的長、寬；菌絲的直徑與隔膜；子囊孢子的長、寬；子囊果的大小等。刺梨在受到白粉菌侵襲時,在菌絲周圍發(fā)現H2O2的迅速累積,在被侵襲部位觀察到胼胝質的積累。刺梨的幾丁質酶和葡聚糖酶的表達水平在白粉菌接種前后差異顯著。
　　 2.利用同源序列法克隆了刺梨抗病基因類

3、似物(Resistance Gene Aanalogues,RGAs),研究了RGA基因的序列多態(tài)性、系統(tǒng)進化、遺傳定位、與抗病位點關系、側翼序列信息,并與薔薇科多種果樹作物的RGA基因進行了比較分析。從刺梨基因組中,得到了96個具有開放讀碼框架的RGA基因,其中34個RGA來源于抗病親本-貴農6號,30個來源于感病親本-貴農5號,32個來源于它們的F1后代。比較發(fā)現抗病親本和感病親本序列之間的核苷酸同源性平均值是54％,稍高于抗病親本

4、的34個序列內部的同源性52％。系統(tǒng)進化分析可以把這96個基因明顯分為兩大類:一類與nonTIR類型R基因同源性較高且含有該類型R基因的特異結構域,而另一類則含有TIR類型R基因的特異結構域。遺傳作圖把這96個基因定位到3個連鎖群:最大的含有23個標記,命名為CR1,基因主要來源于抗病親本和F1代；第二個連鎖群CR2含有12個標記,全部來源于感病親本；第三個連鎖群CR3有6個標記。在第三個連鎖群檢測到一個抗白粉病QTL,離該QTL最近的

5、RGA基因為RGA22。把這三個連鎖群中的RGA基因的位置和進化樹的位置比較分析發(fā)現,在一個進化枝上的RGA基因在遺傳圖上往往也緊密“捆綁”在一起,這是由于基因的串聯重復(tandem duplication)之后序列分化造成的；另一種情況是來自明顯不同進化枝的RGA基因在作圖時定位在一塊；形成雜合性基因簇(heterogeneous cluster),可能起源于RGA基因簇區(qū)域之間的異位重組(ecotopic recombinatio

6、n)。從親本到F1代,還觀察到了RGA基因片段缺失的現象,與RGA基因的減數分裂不穩(wěn)定有關。利用TAIL-PCR策略,在RGA基因側翼分離到了一個轉座子類似序列,Southern雜交分析發(fā)現該基因的拷貝數在抗病親本中較高,在種內,種間拷貝數有很大的差異,轉座子極有可能參與了抗病新位點的形成。利用已經發(fā)表的薔薇科RGA基因,我們分析了來自刺梨、蘋果、桃、梨、草莓、杏和李等228個RGA基因,在屬間、種間進行了比較分析,探索了RGA存在共線

7、性的可能。進化分析還發(fā)現處于第125的組氨酸處于正向選擇,補充了產生抗病新位點的動力。
　　 3.防衛(wèi)相關基因(Defense-related genes,DR genes)在刺梨基因組的存在形式為基因家族,各成員之間多態(tài)性多為單核苷酸(SNP)多態(tài)性,其中幾個成員響應于白粉菌侵襲。從刺梨抗病品種-貴農6號克隆了30個防衛(wèi)相關基因,9個PTO-like激酶基因,21個病程相關蛋白基因(Pathogenesis-related g

8、enes),其中12個PR2基因,9個PR5基因。多態(tài)性主要由單核苷酸位點(SNP)構成,包括點突變、小插入/缺失(InDel)構成。PR5基因平均出現一個SNP頻率為59 bp,PR2基因是64 bp?；赟NPs,我們開發(fā)了SNAP標記,共設計了23對引物,最后17個標記可以在F1群體定位。反向Northern表達分析表明,PR2數個基因在接種后的表達有所增強,PR5基因中的一個在接種后的表達明顯增強。
　　 4.提出了刺梨

9、抗白粉病新途徑--光呼吸。首先構建了抗白粉病相關基因富集的抑制消減(SSH)文庫,反向Northern篩選了其中的300個克隆。測序之后發(fā)現最為顯著的是一些光呼吸相關的基因如核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)、Rubisco激活酶、乙醛酸轉氨酶、谷氨酸轉氨酶、甘油醛脫氫酶、鐵氧還原蛋白和轉運蛋白等。還有一些是已報道抗病相關的基因,如PR10、P450、泛素、STK-like kinase基因、Cf-9類似基因、LRR受

10、體類似激酶等等,轉錄相關基因如NAC基因、Hisone組蛋白基因,甚至是轉座子基因。Real-Time PCR驗證三個光呼吸相關重要基因Rubisco(命名ChrRBCs)、Rubisco激活酶(ChrRBCA)、乙醛酸氨基轉移酶基因(ChrSGT)的表達明顯響應于白粉菌接種。分光光度法檢測也證明這三個酶的活性在白粉菌接種后明顯上升。遺傳作圖發(fā)現這三個基因在刺梨基因組中聚類在一起。用RACE技術獲得了這三個基因的全長,分別為812,93