第四章、細菌遺傳學i

1、第四章、細菌遺傳學I,內容,介紹當前對質粒分配和拷貝數(shù)控制的調控機制的研究，（參考教材101頁）,學習要求,認識質粒分配與不相容性,質粒分配與不相容性,質粒,質粒是能獨立于寄主染色體而自主復制并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子絕大多數(shù)的質粒是DNA型 目前已知只有酵母殺傷質粒(killer plasmid)是RNA型絕大多數(shù)的天然DNA質粒為共價、閉合、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA (covalently close circu

2、lar DNA )質粒DNA的分子量范圍：1 - 200 kb,知識點回顧,已學知識點回顧,一、質粒分配與不相容性,混合配對模型,Random positioning of incompatible plasmids.,A. Sibling plasmids are initially paired, segregated and positioned along the cell. As fresh replicas are gen

3、erated during the cell cycle, the positioning mechanism continues to be activated and to reposition plasmids two at a time, leading to asymmetric plasmid distribution and often to the absence of a plasmid from one cell-h

4、alf.,B. A large partition complex is more likely than a smaller one to activate and stabilize the positioning process. The plasmid with the larger centromere (circle) is thus more likely than that with the smaller one (o

5、void) to be chosen for positioning and to be placed at the centres of the cell-halves; plasmids with smaller centromeres are more likely to wander and be lost. Note that repositioning will tend to moderate a preference f

6、or positioning plasmids with largecentromeres/partition complexes.,Indirect pairing. Partition does not necessarily start by breaking the ParB–ParB interactions responsible for pairing partition complexes on sibling pla

7、smids. Instead, ParA can be activated by a ParB–DNA entity that consists of either an isolated ParB–parS complex, a paired complex (as shown) or an ensemble in a plasmid cluster. Partition ensues when the activated ParA

8、encounters another ParB–DNA entity, which may never have been in contact with the activating one. Thus, plasmids can be segregated as either clusters, pairs or individuals.,問題：細胞內的質粒是平均分配的么？,,ParB不直接相互作用的質粒間也可發(fā)生分配,二、 質粒復

9、制（拷貝數(shù)）與不相容性,質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制,并賦宿主細胞特定的遺傳性狀.質粒DNA的復制方式: 主要有“θ”型復制和滾環(huán)復制根據(jù)在每個細胞中拷貝數(shù)的多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停?① 嚴緊型質粒(Stringent plasmid) ② 松弛型質粒(Relaxed plasmid) 一種質粒究竟是屬于嚴緊型還是松弛型并不是絕對的，同一質粒在不同的宿主細胞中可能

10、具有不同的復制型，這說明質粒的復制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制，同宿主的狀況有關。,（一）、質粒復制的調控,為與宿主穩(wěn)定地共存并把代謝負擔減至最低, 質粒必須控制自身的復制。在一定的生長條件下、在一定的宿主菌中, 某一質粒的拷貝數(shù)(N) 通常是一定的。負調控模型 質粒剛移入新宿主時,負調節(jié)因子的濃度可忽略不計, 質粒能在短時間內達到正?？截悢?shù), 然后通過增加或減少每細胞周期每質?？截惖膹椭坡蕘碚{節(jié)細胞

11、中的質?？截悢?shù)(N), 使該菌群中各細胞的質?？截悢?shù)維持在平均值(Nav )附近的一個很小的波動范圍內。 上述控制機制是由質粒自編碼的負控制系統(tǒng)通過調控復制起始率而實現(xiàn)的, 其負控制元件就編碼在質粒上依所用負控制元件的類型不同, 質粒復制的控制系統(tǒng)主要有: 重復子控制和反義RNA控制,復制起始蛋白Rep 蛋白能以二體形式結合于啟動子區(qū), 反式作用, 對其合成進行自我調節(jié);Rep 蛋白對復制具有雙向調控作用, 且視它的

12、胞內濃度而定, 當胞內濃度低時起復制激活劑作用, 胞內濃度高時則起抑制劑作用?！笆咒D”模型( “handcuffing”model),1、重復子控制,空間位阻模型,空間位阻模型認為, 決定質粒復制率的主要因素是重復子的濃度而不是Rep 蛋白的表達水平。當質粒拷貝數(shù)較低時, Rep蛋白與重復子結合并飽和, 促發(fā)復制起始; 隨著質?？截悢?shù)的增加, 結合于某一起點重復子的Rep 分子, 開始與結合于另一起點重復子的Rep 分子相互作用, 并

13、通過Rep- Rep 相互作用把2個環(huán)狀質粒分子偶聯(lián)起來, 形成“手銬”狀的復合物, 導致這2個重復子區(qū)域之間出現(xiàn)空間位阻而阻斷復制的起始。在隨后的細胞生長期間, 這種質粒對也逐漸分離, 使各質粒分子的復制起始潛力得以恢復。,⒉ 反義RNA控制,在這一模式中,由質粒編碼的抑制因子(反義RNA)結合在復制起始區(qū)的特定靶位點上,對復制起負調控作用。反義RNA : 小RNA 分子, 長35～150 nt, 有1～4個莖-環(huán)( ste

14、m-loop) , 其序列與靶轉錄物 5' 端的一個區(qū)域互補, 又稱反轉錄RNA( countertranscribed RNA, ctRNA)反義RNA的作用方式主要有以下兩種: ⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1質粒為例來說明) ⑵ 抑制前導肽翻譯 (以R1質粒為例來說明),⑴抑制引物RNA 加工,ColE1 質粒的復制起始由一長為700 nt 的轉錄物RNAⅡ(prep

15、rimer)引發(fā)。RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 經(jīng)構象變化后, 與模板DNA在復制起始區(qū)附近偶聯(lián)(coupling)形成RNAⅡ-DNA雜交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 產(chǎn)生游離的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 從這個游離的3’ - OH開始DNA前導鏈的合成。3‘ - OH的生成是復制起始的限速步驟, 受反義RNA(RNAⅠ)調控。RNAⅠ序列與RNAⅡ的前108 堿基序列完全互補, 互補區(qū)結

16、合可改變RNAⅡ下游效應位點的二級結構, 使RNAⅡ的3’ 端不能與模板DNA偶聯(lián),RNase H 就不能對RNAⅡ進行加工, 從而阻斷引物的生成, 抑制復制的起始。,,控制復制引物與模板的結合RNAⅠ的啟動子是組成型的, 故其數(shù)量與質?？截悢?shù)成正比, 但不穩(wěn)定。在ColE1 中還有一個質粒編碼的控制元件Rom 蛋白(又稱Rop 蛋白) , Rop蛋白是RNA 結合蛋白, 它能增強RNAⅠ與RNAⅡ的相互作用, 穩(wěn)定RNAⅠ- RN

17、AⅡ復合物, 因而能加強對復制的抑制作用, 但在上述控制回路中只起輔助作用。,除RNA1以外還有Rop 蛋白強化這種抑制,⑵ 抑制前導肽翻譯,這種作用方式的例子是質粒R1（兩種方式）, 它的基本復制子含有可讀框copB、tap 和repA, 分別編碼轉錄阻遏蛋白CopB、前導肽TAP和起始必需蛋白RepA。tap 和repA 是翻譯偶聯(lián)的。RepA蛋白是復制的限速因子, 以順式作用, 但不能重復使用, 其復制控制在轉錄和翻譯兩個水平上

18、進行。主控制元件是RNAⅠ,從repA-mRNA 前導區(qū)的一段互補鏈轉錄而來, 長約90 nt。質?？截悢?shù)(基因劑量)與RNAⅠ水平呈正相關,CopB可以二聚體形式阻遏repA始自PrepA啟動子(位于copB下游)的轉錄。在穩(wěn)態(tài)條件下，CopB呈飽和濃度，可充分阻遏repA始自PrepA的轉錄，使其維持在基線水平。此時，repA mRNA 主要以copB-tap-repA RNA 多順反子形式合成。但在質粒定居的早期階段，質粒拷貝數(shù)

19、很低，CopB介導的阻遏失效。此時， PrepA啟動子去阻遏，repA 轉錄為tap-repA mRNA，,質粒不相容性的原因 質粒的不相容性現(xiàn)象主要是與質粒的復制調控和分離(segregation)機制有關，不能在同一細胞中并存的質粒是因為他們共享一個或多個共同的復制因子或相同的分配系統(tǒng)。(對于單拷貝質粒???)當兩種復制及調控機制毫不相干的質粒在同一個細胞中生存時,它們各自復制,再各自分配到不同的子細胞中,不

20、會發(fā)生干擾。當兩種復制及調控機制相關或相同的質粒在同一個細胞中生存時,質粒復制及調控機制就會把它們看做成同種質粒而將他們的拷貝數(shù)控制在一定的數(shù)目內。由于細胞時質粒在子細胞中分配不均勻的緣故,經(jīng)過幾十次的細胞分裂后,就會造成敏感質粒的分離丟失。,2、 質粒不相容性,不相容性的分子生物學基礎是質粒的復制調控機制存在同源性,此外具有相同復制起始位點和分配區(qū)的兩種質粒也不能共存于同一個宿主菌 影響不相容性的主要因素: ⑴質粒分離機