豬肌肉組織特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和檢測.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，獲得特異性強(qiáng)且無生物安全隱患的高效啟動子成為研究熱點(diǎn)。本實驗以蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)為介導(dǎo)，在實驗室前期已經(jīng)分離獲得的具有較高調(diào)控能力兼具肌肉組織特異性表達(dá)的α-actin啟動子的基礎(chǔ)上，將蛻皮素誘導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒中可廣譜表達(dá)外源基因的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性啟動子α-actin。構(gòu)建豬肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并在細(xì)胞水平上驗證該肌肉特異性誘導(dǎo)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因時是否兼?zhèn)浣M織特異性和可調(diào)控性，為基因治療和外源基因在骨骼

2、肌組織的特異性表達(dá)提供實驗依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.將蛻皮素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒pVgRXR中的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性表達(dá)的α-actin啟動子，選取綠色熒光蛋白EGFP為報告基因構(gòu)建誘導(dǎo)系統(tǒng)中的反應(yīng)質(zhì)粒pIND-EGFP，用于檢測雙載體表達(dá)系統(tǒng)是否可以成功表達(dá)外源基因。研究結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可啟動外源基因的表達(dá)。
　　 2.將以上系統(tǒng)中的EGFP報告基因替換為β-半乳糖苷酶L

3、acZ基因用于檢測該系統(tǒng)的表達(dá)活性。實驗結(jié)果顯示該誘導(dǎo)系統(tǒng)報告基因表達(dá)量在一定的范圍內(nèi)均與誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑量呈正比例關(guān)系，分別在誘導(dǎo)時間為72 h和誘導(dǎo)劑量在36μM時達(dá)到最大值，之后表達(dá)基本持平，并發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在分化的C2C12細(xì)胞（即肌管）中的表達(dá)要極顯著高于未分化的C2C12細(xì)胞(p＜0.01)，證明了該系統(tǒng)可在肌管中特異表達(dá)。
　　 3.利用β-半乳糖苷酶LacZ基因為報告基因，將該肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染小鼠C2C12

4、細(xì)胞，通過G418篩選，成功篩選出能穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶基因的5株陽性單克隆細(xì)胞株，建立了可用于肌肉誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，為下一步其它實驗提供了基礎(chǔ)。
　　 4.構(gòu)建了以豬MyoD基因為外源基因的豬肌肉特異性誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pVg-actin/pIND-MyoD，將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染分化7天后的小鼠C2C12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)劑濃度為36μM，誘導(dǎo)時間為48 h的實驗組中MyoD基因的表達(dá)量是未加誘導(dǎo)劑的對照組表達(dá)量的17倍，充分證明了該誘導(dǎo)