稻瘟菌中部分絲氨酸蛋白酶的功能研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶廣泛存在于病毒、細(xì)菌和真核生物中，具有蛋白水解活性，而稻瘟菌在致病過程中分泌的具有蛋白水解活性的蛋白酶，被認(rèn)作是潛在的致病因子；為了進(jìn)一步了解絲氨酸蛋白酶在稻瘟菌的生長(zhǎng)與致病過程中的功能，本文初步分析了稻瘟菌中部分絲氨酸蛋白酶的基因功能。 根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，MGSP2(MGG_02863.6)具有較高的蛋白分泌活性，與稻瘟菌中已知的絲氨酸蛋白酶spm1的同源性高。通過構(gòu)建絲氨酸蛋白酶MGSP2的缺失與過量表達(dá)載體

2、，轉(zhuǎn)化野生型菌株KU70原生質(zhì)體，獲得敲除突變體△kosp2和過表達(dá)突變體△863oe，通過對(duì)突變體進(jìn)行表型分析，觀察其在菌落形態(tài)、產(chǎn)孢及致病性等方面的表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除突變體△kosp2在生長(zhǎng)速度、菌絲生長(zhǎng)，產(chǎn)胞能力、附著胞的穿透能力以及致病性方面同野生型相比沒有顯著區(qū)別，說明MGG_02863.6的基因功能有一定冗余性。 過表達(dá)突變體△863oe在致病性方面同野生型相比一樣沒有區(qū)別，但生長(zhǎng)速度比起野生型略快，利用S

3、DS脅迫來觀察細(xì)胞壁的完整性，發(fā)現(xiàn)△863oe對(duì)SDS抗性較強(qiáng)，說明細(xì)胞完整性增強(qiáng)，表明MGSP2基因過表達(dá)后.細(xì)胞作為一個(gè)整體，抗外界壓力增加，因此MGG_02863.6可能是細(xì)胞完整性正調(diào)控因子。 同時(shí)，從稻瘟菌數(shù)據(jù)庫中找出編碼部分絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的保守核苷酸序列，構(gòu)建RNAi載體p733R，轉(zhuǎn)化KU70原生質(zhì)體，獲得突變體△733r-30，△733r-37，通過表型分析發(fā)現(xiàn)，突變體生長(zhǎng)速度沒有發(fā)生改變，但菌落氣生菌絲減少