不結球白菜冷誘導差異表達基因的篩選及功能分析.pdf

1、隨著全球極端災害性天氣頻發(fā)，冷害成為蔬菜生產上的一個嚴重問題，造成蔬菜品質下降以及嚴重減產，直接影響冬、春季蔬菜周年供應。冷害影響植物的生長和發(fā)育，包括:滲透脅迫和次級脅迫如過氧化物脅迫等，常常導致植物細胞骨架結構破壞、膜脂相變、細胞水分虧缺、體內酶的活性降低和光合速率下降。但植物對冷害脅迫的響應并非是完全被動的，為了適應抵抗冷害，植物在長期的進化過程中，形成了相應的保護機制。對模式植物擬南芥的研究表明，冷馴化是一個由眾多基因協(xié)同調控，

2、有著復雜調控網絡的過程，其中少數(shù)關鍵性調控基因控制著大量基因的表達。
　　 不結球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)經過一段零度以上的冷誘導，即冷馴化過程，可以獲得一定的抗寒能力，但對其機理的研究較少。采用cDNA-AFLP技術，以不結球白菜抗寒自交系043為材料，從轉錄組水平上分離冷誘導差異表達的相關基因，為探明不結球白菜冷馴化的分子機理提供理論依據。主要研究結果如下:

3、r>　　 1.不結球白菜冷誘導相關基因差異表達的cDNA-AFLP分析
　　 采用cDNA-AFLP技術，對不結球白菜抗寒自交系043在冷誘導(4℃)下差異表達的基因進行了分析，256對引物組合共篩選了9960個cDNA片段，獲得差異片段77個。其中上調表達的基因片段為57個，下調表達的基因片段為20個。對其功能比對發(fā)現(xiàn)，這些TDFs分別參與了基礎代謝、光合作用和能量、轉運、信號轉導、次生代謝、防御響應、轉錄、細胞骨架結構，另

4、外還有一些假想和功能未知蛋白。同時選取TDF16#、TDF21#和TDF57#進行實時定量PCR分析，結果表明這三個TDFs受冷脅迫的誘導表達，在不結球白菜冷馴化過程中可能具有重要作用。構建了不結球白菜在冷誘導下的基因表達譜，從轉錄組水平上鑒定了一批冷誘導相關基因，這些新基因可用于冷馴化的分子機理研究。
　　 2.不結球白菜冷誘導相關基因BcWRKY46的克隆及功能分析
　　 WRKY轉錄因子能廣泛地參與植物的生物與非生

5、物脅迫反應。以cDNA-AFLP技術，從不結球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片段TDF21#，進一步利用RACE技術獲得了該基因cDNA全序列1175 bp，包含有855bp的開放閱讀框，編碼284個氨基酸，命名為BcWRKY46。qRT-PCR結果表明，該基因表達不僅受冷脅迫誘導，還響應其它脅迫，包括鹽、干旱和ABA。過量表達BcWRKY46的轉基因煙草提高了抗寒、鹽、干旱和ABA脅迫的能力。結果表明，B

6、cwRKY46在提高ABA和非生物脅迫的抗性過程中有著重要的作用。
　　 3.不結球白菜冷誘導相關基因BcMCSU的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術，從不結球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片段TDF16#，進一步利用RACE技術獲得了該基因全長序列1194 bp，包含有926 bp的開放閱讀框，編碼307個氨基酸，命名為BcMCSU。其氨基酸序列與擬南芥AtMCSU編碼的氨基

7、酸序列具有較高同源性。蛋白結構域分析表明:所推導的氨基酸序列具有完整的結構，在其N-端和C-端分別含有一個MOSC結構域。采用Gateway技術構建植物過量表達載體，通過農桿菌介導的真空滲透法將其轉入野生型擬南芥中，經除草劑篩選，獲得了抗性轉基因擬南芥。
　　 4.不結球白菜冷誘導相關基因BcVIN3的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術，從不結球白菜抗寒自交系043冷誘導(4℃)的葉片中得到的一個差異表達片