家蠶限性黃繭Ys品種SSHcDNA文庫構建及類胰凝乳蛋白酶基因的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式生物,其天然有色繭是具有重大應用前景的遺傳資源。目前,國內外家蠶有色繭分子遺傳研究和應用還剛剛起步,由于家蠶繭色受多基因調控,遺傳機制了解不詳,挖掘和研究繭色調控基因是被公認的有效突破口之一。
　　 家蠶Ys品種是本研究室選育和保存的限性黃繭品種,其雌為黃繭,雄為白繭,為研究黃、白繭之間差異表達基因提供了非常好的材料。本文以家蠶限性黃繭Ys品種為材料,用抑制性消減雜交技術(SSH)構建了Ys品種雌特異表達基因的c

2、DNA文庫,結合RACE-PCR技術和生物信息學方法對雌雄差異表達的類胰凝乳蛋白酶基因(Chymotrypsin-like proteinase gene,Ctlp gene)進行了克隆鑒定、蛋白質結構和分子進化分析,用RT-PCR和Real-Time PCR等技術調查了5齡3天不同組織中Ctlp基因的表達譜,并進行了原核表達初步研究。獲得的主要結果如下:
　　 1家蠶限性黃繭Ys品種雌特異表達基因的cDNA文庫
　　

3、在SSH方法構建的家蠶限性黃繭Ys品種雌特異表達基因的cDNA文庫中,隨機挑選克隆測序得到94個EST,其中9個為有確定注釋的EST序列,5個EST序列是未知的。有注釋的EST序列分別為NAPDH氧化還原酶、真核起始因子5A,熱休克同源蛋白、絲氨酸蛋白酶前體、包含絨毛膜基因序列基因、β-微管蛋白和3個核糖體RNA和蛋白基因。WEGO分析結果表明這些注釋基因主要分為細胞組成、分子功能和生物進程三部分,參與了能量代謝、細胞組成、結合活性和催

4、化活性等各種復雜的生命活動。
　　 2克隆鑒定了家蠶類胰凝乳蛋白酶基因Ctlp
　　 選擇在家蠶雌性消化管特異高水平表達的EST進行了基因挖掘與克隆,克隆基因的全長cDNA序列976 bp,最長ORF為840 bp,編碼279個氨基酸。蛋白序列分析表明,該基因編碼的蛋白質屬于分泌蛋白,蛋白分子量為29780.10(或29781.00),等電點8.75(或9.07),在其氨基酸殘基1-20和50-100兩個區(qū)域有由內到外的

5、跨膜螺旋,該蛋白的α螺旋約占17.56％,延伸鏈約占27.60％,β轉角約占8.60％,隨機卷曲結構約占46.24％。含有1個N-糖基化位點、2個蛋白激酶C磷酸化位點、11個N-十四?；稽c、1個胰蛋白酶家族中絲氨酸蛋白酶的組氨酸活性位點、1個胰蛋白酶家族絲氨酸蛋白酶的絲氨酸活性位點、1個氨甲酰磷酸鹽合成酶亞基標簽2。蛋白功能域(保守區(qū))分析結果表明,該基因編碼蛋白質的38-274位氨基酸屬于胰蛋白酶類似的絲氨酸蛋白酶結構域,分子進化分

6、析表明,該蛋白屬于昆蟲的胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin),與煙芽夜蛾(Heliothis virescens,H.virescens)、甜菜夜蛾(Spodopera exigua,S.exigua)和棉鈴蟲(Heliothis armigera,H.armigera)等鱗翅目昆蟲的親緣關系最近,與脊椎動物的進化關系較遠,符合傳統(tǒng)意義上的進化關系。因此命名該基因為類胰凝乳蛋白酶基因(Chymotrypsin-likeprotein

7、ase gene,Ctlp gene)。
　　 3家蠶Ctlp基因的表達譜結果
　　 家蠶EST表達譜分析結果表明,Ctlp基因只在家蠶幼蟲期的中腸特異表達。芯片表達譜分析結果顯示,Ctlp基因在大造雌雄共18個組織(器官)中的表達水平有顯著差異,特異性的幾乎只在中腸表達。
　　 RT-PCR組織表達譜和Real-Time PCR定量分析結果表明,Ctlp基因在家蠶Ys品種5L-3d幼蟲的中腸和生殖腺中均有表達,