牛消化道Ⅰ型肽載體(bPepT Ⅰ)部分序列的克隆、表達及多克隆抗體的制備.pdf

1、牛消化道Ⅰ型肽載體（bPepTⅠ）蛋白表達量的檢測有助于小肽吸收營養(yǎng)學重要性的研究。本研究應用原核表達重組技術制備bPepTⅠ的多克隆抗體，以用于其蛋白表達量的免疫學測定。
　　 用DNAStar軟件對bPepTⅠ的DNA全序列進行了抗原性指數(shù)分析，并結合該蛋白的跨膜結構，從胞外環(huán)篩選出高抗原性指數(shù)片段（bPepTⅠ ORF的1369-1695bp片段）。取牛瘤胃組織樣品，用Trizol法提取總RNA，以反轉錄得到的cDNA為模

2、板，采用PCR擴增技術，擴增得到與預期大小相符的片段，命名為BP片段。將該片段與原核表達載體pGEX-6p-1和pET-32a連接，得到的正確重組質粒分別命名為GST-BP和His-BP。采用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切及測序方法雙重鑒定重組質粒的正確性，結果表明，目的片段已定向克隆到原核表達載體上，且克隆的BP基因片段與Genbank登錄的標準序列有較高的同源性（99.1％），不會影響后續(xù)的蛋白表達工作。用鑒定正確的GST-

3、BP重組質.粒轉化BL21菌株，His-BP重組質粒轉化原核表達菌株BL21（DE3）。IPTG在不同時間和濃度下誘導GST-BP/BL21轉化菌株GST-BP/BL21外源蛋白的表達，誘導的重組菌處理后經SDS-PAGE電泳確定IPTG最佳誘導條件。最佳條件下大量誘導GST-BP在BL21菌株中的表達，同時進行重組載體His-BP在BL21（DE3）菌株中的誘導表達，應用SDS-PAGE電泳和Westernblot方法相結合鑒定轉化菌

4、株表達蛋白的準確性，結果表明，GST-BP/BL21表達得到38.1kDa左右的蛋白，His-BP/BL21（DE3）表達得到31kDa左右的蛋白，與預期的蛋白分子量大小相符，因此，試驗成功獲得表達目的蛋白的重組菌株。
　　 培養(yǎng)GST-BP/BL21重組菌株，超聲波破碎菌體后確定表達蛋白的可溶性，結果表明，重組蛋白以包涵體的形式存在。包涵體蛋白電泳后，切下目的蛋白帶所在的膠條免疫小鼠，加強免疫3次后，小鼠尾靜脈采血，獲得目的蛋

5、白的抗血清。首先用His-BP融合蛋白做抗原，免疫印跡方法鑒定抗體的特異性，結果表明，本研究獲得了抗bPepTⅠ目標片段的抗體。接著用不同濃度的GST-BP蛋白為包被抗原，不同稀釋度的抗血清做一抗，間接ELISA測定最佳工作條件結果表明，GST-BP抗原最佳包被濃度是0.5μg/mL，抗血清的最佳稀釋度是1:400。用包被緩沖液將GST-BP抗原稀釋至0.5μg/mL，鼠疫抗血清按1:400，1:1600，1:6400，1:25600，