家蠶Roadblock功能域基因和幾丁質脫乙?;富虻姆肿涌寺∨c功能分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、轉化生長因子β(transforming growth factor)超家族由一類結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成,其中包括TGF-β、活化素(activin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)等。TGF-β除了影響細胞的增殖、分化外,還在胚胎發(fā)育、胞外基質形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。TGF-β家族成員廣泛存在于從果蠅到人等多種生物的各種組織中,對正常細胞、癌變細胞都有著顯著作用。隨著對于TGFβ信號通

2、路研究的深入,其他的一些能夠介導各種不同的生物學反應的TGFβ信號通路成員也將陸續(xù)得被發(fā)現。Jin等通過酵母雙雜交篩選鑒定出新的能夠與TGFβ-R結合的蛋白,即Robl1和Robl2,它們是負責運輸的動力蛋白輕鏈。當細胞受到TGFβ信號分子刺激后,Robl通過TGFβ-RⅡ磷酸化后激活,激活的Robl與激活的Smad2/3結合并將它們招募到動力蛋白復合體上,最終將Smad2/3運輸到核內DNA上,Smad2/3再和其他一些轉錄因子結合調

3、控靶基因的表達,從而產生各種生物學效應。由于Robl基因的許多新功能還未全部解明,通過研究家蠶中Robl基因的功能和產生的生物學效應,是解析Robl基因新功能的有效途徑。
   TOR(雷帕霉素靶標)作為一種重要的調節(jié)基因,TOR匯聚了來自細胞內外的營養(yǎng)、生長因子、能量和環(huán)境壓力的信號,通過調節(jié)細胞周期、蛋白質合成、細胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能,在細胞的增殖、生長、分化過程中起著中心調控點的作用。mTOR信號的失調會

4、導致很多疾病中出現,包括癌癥和代謝紊亂等?;岽碳つ軌蛘T導mTORC1的激活,而Ragulator的重要成分P14對于TOR信號的激活是必需的。目前的主要研究都是集中在哺乳動物的細胞之中,并且P14具體發(fā)揮功能的機制仍然不清楚,因此,研究它詳細的功能具有重要意義。
   幾丁質脫乙酰基酶(Chitin deacetylases,CDAs)是新近發(fā)現的一種參與調控分解昆蟲幾丁質的重要酶類。幾丁質經CDAs作用形成脫乙酰幾丁質(或稱

5、聚葡萄糖胺),脫乙酰幾丁質又可進一步被CDAs分解成氨基葡萄糖。昆蟲幾丁質脫乙?;傅难芯渴墙鼛啄瓴砰_展的,對其作用與調控機制知之甚少。為了研究昆蟲CDAs作用機制及調控機理,探討CDAs對昆蟲生長發(fā)育的影響,我們采用了生長發(fā)育特征明顯、體內組織器官易于區(qū)分的大型模式昆蟲-家蠶作為研究材料,對家蠶CDAs基因結構、mRNA選擇性剪切模式及不同剪切體表達差異進行了研究。
   本論文在分析大量家蠶組織EST數據、基因組數據等的基礎

6、上,利用RT-PCR和RACE技術克隆了家蠶BmRobl基因、BmP14基因和BmCDAs基因,并對BmRobl與BmCDAs基因的功能做了研究,具體研究結果如下:
   1、通過數據庫檢索、電子克隆、RT-PCR等方法克隆了家蠶BmRobl、BmP14基因,BmRobl cDNA全長序列由853 bp堿基組成,5’UTR和3’UTR分別為60bp、469bp,ORF長294bp,編碼97個氨基酸;BmP14cDNA全長序列由1

7、263bp堿基組成,5’UTR和3’UTR為176bp、709bp ORF長378bp,編碼125個氨基酸。利用生物信息學的方法解析氨基酸序列的結構與功能域信息,BmRobl與BmP14氨基酸序列都含有一個Roadblock功能域。BmRobl與BmP14蛋白的同源性只有9%,但BmRobl與脊椎動物的P14蛋白的同源性反而比家蠶自身高,具有12%的同源性。在已知的物種中,Robl蛋白與P14蛋白的氨基酸相同率都在10%左右,同源性較低

8、。Robl和P14都含有一個相似的Roadblock功能域,但它們的序列相差很大,進化樹分析暗示它們可能屬于Robl超家族的2個不同亞家族。Robl蛋白Roadblock功能域由2個α螺旋和5個β折疊形成,P14蛋白的Roadblock功能域由3個α螺旋和5個β折疊形成;Robl蛋白的2個alfa螺旋包圍著5個β折疊形成類似三明治的結構,而P14蛋白含有3個α螺旋,其中一個α螺旋插入到beta折疊中,余下的2個α螺旋在它們兩端,這說明雖

9、然Robl和P14均是由α螺旋和β折疊形成的Roadblock功能域構成,但其結構還是存在差異,暗示著Robl和P14在生物學功能上的差異。
   2、利用原核表達系統表達了BmRobl蛋白,制備了多抗,經western blot檢測發(fā)現特異性良好,為下步實驗做好了準備。
   3、通過Realtime PCR技術對BmRobl基因組織特異性表達和時期特異性表達進行了分析,發(fā)現BmRobl在家蠶組織中的差異表達,此基因在

10、各組織中均有表達,但在大腦、翅原基已及性腺中的表達水平較高。因為Robl在有絲分裂和減數分裂過程發(fā)揮著重要的功能,且對軸突的運輸和成精神細胞的生成至關重要;而卵巢和精巢產生配子減數分裂旺盛,翅原基在胚胎后期需要進行有絲分裂,大腦的信號指令需要軸突的運輸;所以BmRobl在大腦、卵巢、精巢和翅原基中高水平表達。我們還分析了不同發(fā)育時期BmRobl,基因在翅原基的表達變化。結果顯示BmRobl轉錄體在預蛹期的水平最高,在進入蛹期后表達水平下

11、調。家蠶的預蛹期和蛹期是變態(tài)期,在此過程中,一些組織發(fā)生程序性細胞凋亡,另一些組織如翅原基通過細胞分裂激劇生長。BmRobl基因在家蠶變態(tài)期的表達變化顯示BmRobl基因可能在變態(tài)期的組織生長、細胞分裂過程中扮演著重要的角色。
   4、分析了家蠶細胞系BmRobl基因在紫外和釩酸鹽刺激條件下,mRNA水平和蛋白質水平所發(fā)生的變化。熒光定量PCR和免疫印記實驗結果表明,BmRobl基因隨著紫外刺激的時間和釩酸鈉培養(yǎng)濃度的增加,無

12、論是在mRNA水平還是蛋白質水平都顯著下調。紫外和釩酸鹽共處理與只是紫外或釩酸鹽單獨處理相比,下調的更加顯著,這暗示著Robl可能是一個保守的光刺激敏感基因,紫外刺激和釩酸鹽可能協同地發(fā)揮作用下調BmRobl基因。
   5、利用RACE法克隆了家蠶CDAs的cDNA全長序列,鑒定出BmCDAs基因mRNA存在2種剪接體,命名為BmCDA1和BmCDA2,外顯子遺漏是BmCDA1和BmCDA2的mRNA的主要剪接模式。利用生物信

13、息學方法分析表明BmCDA基因組由6個外顯子和5個內含子組成;推測BmCDA1和BmCDA2的氨基酸序列都包含幾丁質脫乙酰基(CDA)結構域、幾丁質結合(ChBD)結構域和低密度脂蛋白受體類A(LDLa)結構域等3個功能域,但二者的ChBD結構域有部分氨基酸殘基不同。基于功能域基序和系統進化法分析,昆蟲CDA蛋白可分成5大類,BmCDA1和BmCDA2屬于第1大類,是具有全部3個功能域典型的昆蟲CDA蛋白。熒光定量PCR分析表明BmCD

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