牛腸道病毒VP2蛋白免疫原性研究及診斷方法的建立.pdf

1、牛腸道病毒（Bovine enterovirus，BEV）屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬成員，該病霉于1959年被Moll和Davis首次報(bào)道，已在全世界主要養(yǎng)牛國(guó)家和地區(qū)導(dǎo)致疾病發(fā)生和流行。目前該病在我國(guó)內(nèi)蒙古、山東、吉林、黑龍江、北京均有發(fā)現(xiàn)。感染可引起下痢和呼吸道癥狀，食欲下降，嚴(yán)重的還有便血，產(chǎn)奶量大幅下降，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國(guó)對(duì)牛腸道疾病的診斷和防治還很薄弱，完善該病的診斷技術(shù)及研發(fā)亞單位疫苗對(duì)我國(guó)奶牛養(yǎng)殖

2、業(yè)具有重大意義。
　　牛腸道病毒基因組分為不分節(jié)段的的單股正鏈的RNA，可直接作為mRNA翻譯出一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過(guò)一系列降解，產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。據(jù)研究證實(shí)，抗原決定簇位于暴露在病毒顆粒表面的VP1、VP2、VP3上，且抗VP2抗體中和病毒能力最好，表明VP2蛋白是研究BEV的首選特異性抗原。而3D區(qū)域較為保守，可作為BEV分子生物學(xué)檢測(cè)的

3、首選序列?；诖?，該實(shí)驗(yàn)做了以下方面的研究工作。
　　1開展牛腸道病毒VP2蛋白免疫原性研究，為亞單位疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增BEV VP2基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+）-VP2。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21，IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)VP2融合蛋白，Western-blot檢測(cè)目的蛋白。將純化的重組蛋白(pET32a(+)-VP2)免疫新西蘭大白兔，制備VP2多克隆抗體，iELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，同時(shí)

4、利用血清中和實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其誘導(dǎo)中和抗體的能力。SDS-PAGE分析顯示，融合蛋白的分子量為50KD，與預(yù)期值大小相符。檢測(cè)其抗體效價(jià)為1∶25600。血清中和實(shí)驗(yàn)表明，原核表達(dá)的VP2蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)為1∶107.4。本研究成功克隆和表達(dá)了具有免疫原性的VP2蛋白，其可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高效價(jià)的多克隆抗體，為BEV血清學(xué)診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　2建立牛腸道病毒分子生物學(xué)檢測(cè)方法，為流行病學(xué)調(diào)查及疫情診斷

5、提供支撐。
　　首先根據(jù)GenBank中公布的BEV3D基因保守序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，以構(gòu)建的含有該引物擴(kuò)增序列的重組質(zhì)粒(pEAST-T3-3D)作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化各種條件，建立了檢測(cè)BEV的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系良好，與牛病毒性腹瀉等其它幾種牛的病毒均無(wú)交叉反應(yīng);其檢出敏感度達(dá)7.13×101拷貝/μL，敏感性比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高10倍。應(yīng)用該方法檢測(cè)了3個(gè)規(guī)?；?/p>