雄激素非依賴性前列腺癌細胞耐藥機制的初步實驗研究.pdf

1、前列腺癌是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌，居男性腫瘤的第二位。美國癌癥學會估計，2009年美國大約有19.228萬名男性被診斷為前列腺癌，約有2.736萬前列腺癌患者死亡[1]。目前，我國前列腺癌發(fā)病率雖遠低于西方國家，但近年來隨著人們生活方式的改變、壽命的延長及醫(yī)療保健和診斷水平的提高，我國前列腺癌發(fā)病率呈顯著增長趨勢，而且與西方國家前列腺癌發(fā)生有所不同，我國前列腺癌患者在初診時往往已為進展期，喪失了手術良機，預后較

2、差，生存期也較短。雄激素去勢治療是除外科手術與放射治療外的標準前列腺癌治療方法，然而經過中位數(shù)為18～24個月的緩解期后，雄激素依賴性前列腺癌（Androgen-Dependent Prostate Cancer，ADPC）轉變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔ˋndrogen-Independent ProstateCancer，AIPC），表現(xiàn)為前列腺癌細胞在緩解期過后又開始增殖，PSA進行性升高，極易發(fā)生骨轉移，轉變后的治療非常棘手，死亡

3、率極高，前列腺癌已成為危害老年男性人群健康的重大疾病。
　　 對AIPC的轉變機制研究，是目前國內外前列腺癌研究領域的熱點，主要涉及：雄激素受體（androgen receptor，AR）基因的擴增；雄激素受體突變；凋亡調控基因的異常，由于前列腺癌的生物學行為極其復雜，以上理論并不能合理地闡述AIPC的發(fā)生機制，雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)病仍需進一步深入研究。
　　 建立一株能模擬臨床上前列腺癌由雄激素依賴轉變?yōu)樾奂に胤且?/p>

4、賴過程的細胞模型，能模擬人前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、結局的生理病理全過程，能夠體現(xiàn)出人前列腺癌各階段的特點，能模擬人前列腺癌基因的改變和前列腺癌對治療的反應。采用現(xiàn)代細胞生物學、分子生物學以及蛋白組學和代謝組學的研究手段，進一步揭示雄激素依賴性前列腺癌向雄激素非依賴性前列腺癌轉化過程中發(fā)生機制，有望為雄激素非依賴性前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。
　　 主要研究內容：
　　 1.在去雄激素的培養(yǎng)環(huán)境和雄激素阻斷劑氟他胺作用下，

5、誘導前列腺癌LNCaP細胞向雄激素非依賴性轉化，建立雄激素非依賴性前列腺癌細胞系-LNCaP-AI細胞系和LNCaP-AI+F細胞系，鑒定雄激素非依賴性前列腺癌細胞系生物學特征變化。
　　 2.研究雄激素非依賴性前列腺癌細胞系-LNCaP-AI細胞系和LNCaP-AI+F細胞系的AR受體通路變化，包括目前AR受體突變分析、AR受體表達變化（mRNA和蛋白質水平）；AR受體對雄激素反應性以及PSAmRNA和PSA蛋白質水平變化；細

6、胞信號通路主要信號蛋白變化。
　　 3.采用PCR、Western Blot和免疫組織化學染色方法檢測了RON基因表達情況，研究受體酪氨酸激酶RON在雄激素非依賴性前列腺癌細胞向雄激素非依賴性前列腺癌細胞轉化過程中作用。
　　 4.利用Solexa高通量測序技術分別對LNCaP和LNCaP-AI+F細胞系的小分子RaNA進行測序，利用生物信息學技術對所得到的大規(guī)模序列進行分析，篩選出與雄激素非依賴性前列腺癌相關的miRN

7、A，同時可能發(fā)現(xiàn)一些新的miRNA，最后對感興趣的miRNA的靶基因進行預測。
　　 主要結果：
　　 1.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系細胞形態(tài)學發(fā)生變化：雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞轉化為雄激素非依賴性前列腺癌細胞-LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系，其形態(tài)學發(fā)生了變化，表現(xiàn)為：細胞胞體變小，呈扁平狀，少見圓形或梭形，多見單個細胞獨立生長，同時出現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象；而LNCaP細胞形態(tài)呈三角

8、形或長梭型，小部分為圓形，分布均勻。
　　 2.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系細胞生長特性發(fā)生了變化：
　　 2.1在去雄激素環(huán)境下，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系生長速度顯著高于LNCaP細胞；氟他胺對生長抑制作用明顯減弱.
　　 2.2 LNCaP-AI細胞系對雄激素的生長反應性明顯下降，僅高濃度雄激素才刺激細胞增殖生長，而低濃度雄激素卻無增殖反應性，但不同濃度雄激素對LNCaP-

9、AI+F細胞生長均無刺激作用，說明LNCaP-AI+F細胞和LNCaP-AI對雄激素反應性也存在差異。
　　 2.3 LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系細胞侵襲能力和細胞遷移活性高于LNCaP細胞，特別是LNCaP-AI+F細胞系細胞遷移活性明顯高于LNCaP細胞。
　　 3.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系細胞AR信號通路變化：
　　 3.1在雄激素依賴性前列腺癌細胞向雄激素非依賴性前列腺

10、癌細胞轉化過程中，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系細胞AR并沒有發(fā)生突變，但LNCaP-AI細胞AR表達上調，而LNCaP-AI+F細胞AR表達下調。
　　 3.2 PSA表達在LNCaP-AI和LNCaP細胞之間無差異（P>0.05），但在LNCaP-AI+F細胞中表達明顯下調（P<0.01）；氟他胺、雙氫睪酮和十一酸睪酮均能刺激LNCaP、LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞表達和分泌PSA，但LNCaP-

11、AI和LNCaP-AI+F細胞對雙氫睪酮和十一酸睪酮反應性下降，特別是LNCaP-AI+F細胞對雙氫睪酮和十一酸睪酮刺激存在PSA轉錄和分泌反應性和對藥物濃度敏感性下降。
　　 4.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞受體酪氨酸激酶表達：結果發(fā)現(xiàn)，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞的RONmRNA、RON蛋白質均為陰性，說明RON基因在前列腺癌從雄激素依賴性向雄激素非依賴性轉變過程中不起作用。
　　 5.L

12、NCaP-AI+F細胞的miRNA表達譜變化：
　　 5.1實驗組LNCaP-AI+F細胞共檢測出376個miRNA，而對照組LNCaP細胞共檢測出357個miRNA。存在表達差異miRNAs有94個，其中48個表達上調，46個表達下調。
　　 5.2預測新miRNA共有15個，其中LNCaP-AI+F細胞有9個新miRNA，而LNCaP細胞有6個新miRNA。
　　 主要結論：
　　 1.建立了雄激素非

13、依賴性前列腺癌細胞系-LNCaP-AI和LNcaP-AI+F細胞系，其細胞生物學生長特性和對雄激素反應性與LNCaP細胞之間存在明顯差異，為雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)病機制的研究提供了良好的細胞學模型。
　　 2.在LNCaP細胞系轉變?yōu)長NCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系過程中，AR均沒有發(fā)生突變，但LNCaP-AI細胞的AR表達上調，而LNCaP-AI+F細胞的AR表達呈下降趨勢；AR信號通路并沒有被阻斷，但對雄激素反

14、應性下降。提示在長期的去雄激素環(huán)境和氟他胺抑制作用，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞的AR通路存在差異，雖然AR信號通路還是有效地，但對雄激素反應性下降。
　　 3.在LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系中RON基因均沒有表達，提示：RON基因在LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細胞系從ADPC轉變?yōu)锳IPC過程中可能不起作用。
　　 4.在激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞和雄激素非依賴性前列腺癌L