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文檔簡介
1、浙江大學博士學位論文逆轉錄病毒介導人白介素2基因轉染肝干細胞的實驗研究姓名:鄭和鳴申請學位級別:博士專業(yè):外科學(普外科)指導教師:蔡秀軍20070501浙江人學博學位論文中文文摘動物實驗打下基礎。第一部分人白細胞介素2cDNA的克隆及原核載體的構建及其表達目的:通過RTPCR從人體周圍靜脈血中擴增IL一2全長編碼序列,并構建重組原核表達載體PET一32a—IL一2,并在大腸桿菌BL21中表達。方法:分離健康人外周靜脈血單核巨噬細胞,通
2、過細胞總RNA的提取、盯一PCR從人體周圍靜脈血中擴增IL一2全長編碼序列,并將其克隆至T載體中。測序,并利用DNAStar軟件對所測定的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行編輯、分析。將IL一2全長編碼序列克隆至PET一32aIL一2原核表達載體,轉化大腸桿菌BL21,經IPTG誘導表達,并經10%SDS—PAGE凝膠屯泳、考馬斯亮藍染色及Westenblot鑒定。結果:正確擴增出人IL2全長編碼序列,測序結果正確,并分析了人白介素一2的
3、蛋白結構。正確構建了重組原核表達質粒PET32aIL2,測序結果正確,并在大腸桿菌中高效表達。結論:擴增出的人IL一2和文獻報道的cDNA序列一致,并構建重組原核表達質粒PET32a—IL一2。關鍵詞:人白介素一2,克隆,序列分析,原核表達載體,基因表達第二部分攜帶人IL屯基因重組逆轉錄病毒載體的構建及其在PT67細胞中的包裝目的:構建人白介素一2基岡的逆轉錄病毒體系Plpcx—E6FP、Plpcx—IL一2EGFP及Plpcx—IL一
4、2,并研究其在包裝細胞PT67中的表達。方法:采用DNA重組技術,將pEGFPNI質粒用占coRl和NotI進行雙酶切,獲得EGFPcDNA片段,與用同樣酶切的Plpcx載體在LigationMix連接酶的作用下進行連接反應,構建成重組逆轉錄病毒表達載體PlpexEGFP。酶切鑒定,測序證實。以P町一32aIL一2為模板,通過PCR擴增IL2金長編碼序列,刪和EcoRI_)嘆酶切后將該片段克隆至Plpcx—EGFP。構建成重組逆轉錄病毒
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