漢坦病毒包膜糖蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與生物學(xué)活性分析.pdf

1、目的：構(gòu)建漢坦病毒(Hantavirus，HV)GM04-38株包膜糖蛋基因G1、G2的真核表達(dá)載體，并將其在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，研究其表達(dá)特點(diǎn)，并且觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)生，為研究漢坦病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、病毒糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、研制有效的漢坦病毒基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建漢坦病毒糖基化位點(diǎn)的突變體，對(duì)以后研究糖基化位點(diǎn)改變對(duì)細(xì)胞融合的影響具有重要意義。 方法：根據(jù)GenBank SEO型HV M、S片段cDNA基

2、因保守序列及相關(guān)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pUCm-M1和pMD18-M2為模板，應(yīng)用PCR方法分別擴(kuò)增HV糖蛋白G1、G2的全長(zhǎng)基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pCAGGS/MCS分別雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐篩選，酶切和測(cè)序鑒定正確后，兩種載體分別命名為pCAGGS-G1、pCAGGS-G2，然后將兩種糖蛋白載體共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，酸性MEM處理、Giemsa染色后觀察細(xì)胞融合現(xiàn)象的產(chǎn)

3、生。同時(shí)用pCAGGS-NP與兩種糖蛋白載體共表達(dá)，看核蛋白是否對(duì)糖蛋白的融合有增強(qiáng)作用，并以間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay，IIFA)來觀察糖蛋白和核蛋白的表達(dá)情況。利用基因定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了五個(gè)糖蛋白突變體，即將G1、G2上的的天冬酰胺置換為丙氨酸，根據(jù)被替換的位置，突變體分別命名為N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。 結(jié)果: 1．構(gòu)建了

4、含有包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表達(dá)載體pCAGGS-G1和pCAGGS-G2，雙酶切鑒定目的片段分別為2.0kb和1.5kb，載體片段為4.7kb并測(cè)序證實(shí)。 2．間接免疫熒光試驗(yàn)顯示糖蛋白組、核蛋白組及兩者的共表達(dá)組皆有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生，呈胞漿分布。 3．糖蛋白G1、G2共轉(zhuǎn)染后在偏酸性條件下可引起Vero E6細(xì)胞發(fā)生融合，而轉(zhuǎn)染pCAGGS-NP的細(xì)胞則沒有融合現(xiàn)象發(fā)生：將核蛋白與糖蛋白共表達(dá)后也未出現(xiàn)明顯的

5、促進(jìn)效應(yīng)。 4．構(gòu)建了五個(gè)N-連糖基化位點(diǎn)的突變體，測(cè)序圖譜顯示原序列中的天冬酰胺(N)均被置換為丙氨酸(A)。 結(jié)論: 成功構(gòu)建了漢坦病毒包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表達(dá)載體并在Vero E6細(xì)胞中有效表達(dá)，二者的共表達(dá)可以產(chǎn)生良好的生物學(xué)活性，在酸性條件下引起Vero E6細(xì)胞發(fā)生融合。為進(jìn)一步研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，制備有效的亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。成功構(gòu)建了各糖基化位點(diǎn)的突變體，為進(jìn)一步研究N-連糖基化的缺失