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文檔簡介
1、目的:探討改建型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)對人重組干擾素-β(IFN-β)干預(yù)非小細胞肺癌增殖及凋亡的影響,為改建型STAT1治療非小細胞肺癌提供基礎(chǔ)。
方法:
1.慢病毒載體的擴增制備:將保存在溫州醫(yī)學(xué)院呼吸科實驗室的慢病毒載體Lenti-EGFP(含EGFP的對照質(zhì)粒)、Lenti-STAT1(含野生型STAT1基因)及Lenti-STAT1-CC(含改建型STAT1基因)轉(zhuǎn)至大腸桿菌E.
2、coli DH5α內(nèi),再根據(jù)質(zhì)粒大量抽提試劑盒說明書抽提3種慢病毒載體,通過293T人胚腎細胞做為媒介,用氯化鈣方法包裝收集Lenti-EGFP、Lenti-STAT1及Lenti-STAT1-CC慢病毒載體。
2.H1299細胞的轉(zhuǎn)染、分組及鑒定:將Lenti-EGFP、Lenti-STAT1及Lenti-STAT1-CC慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染H1299細胞。根據(jù)有無轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染的不同慢病毒載體,將細胞分為H1299空白組、L
3、enti-EGFP對照組、Lenti-STAT1組及Lenti-STAT1-CC組4組細胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察4組細胞綠色熒光蛋白表達情況,用Western blot檢測4組細胞所表達的STAT1蛋白。
3.IFN-β對各組H1299細胞表達增殖細胞核抗原及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的影響:用不同濃度(分別為0U/L,10U/L,100U/L,1000U/L,2000U/L)的IFN-β干預(yù)4組細胞72h,提取細胞蛋白,
4、Bradford法測定蛋白濃度,Western blot檢測4組細胞所表達的增殖細胞核抗原(PCNA)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASPASE3)。
4.IFN-β對各組H1299細胞增殖活性的影響:用不同濃度(分別為0U/L,10U/L,100U/L,1000U/L,2000U/L)的人重組干擾素-β干預(yù)4組細胞72h后用甲基噻唑基四唑法(MTT)測各組細胞的吸光度值,再計算其生長抑制率。
結(jié)果:
5、 1.將慢病毒載體轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌H1299細胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察到Lenti-EGFP對照組、Lenti-STAT1組及Lent i-STAT1-CC組細胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達,證明已將慢病毒載體轉(zhuǎn)染H1299細胞內(nèi)。
2.H1299空白組、Lenti-EGFP對照組細胞幾乎不表達STAT1蛋白,而Lenti-STAT1組及Lenti-STAT1-CC組細胞有STAT1蛋白的表達。
3.不同濃度I
6、FN-β干預(yù)4組H1299細胞(H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組,Lenti-STAT1-CC組)72h,有如下結(jié)果:(1)在相同濃度IFN-β干預(yù)下,Lenti-EGFP對照組與H1299空白組細胞表達的PCNA蛋白量無差異。(2)在無IFN-β干預(yù)下,各組H1299細胞表達的PCNA蛋白量無明顯差異。(3)相同濃度IFN-β干預(yù)下,Lenti-STAT1-CC組細胞表達PCNA蛋白量比H1299
7、空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組明顯減少,并且Lenti-STAT1-CC組細胞表達PCNA蛋白量隨IFN-β濃度增加而減少。(4)在相同濃度IFN-β干預(yù)下,Lenti-STAT1-CC組細胞表達的PCNA蛋白量的下降率明顯高于H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組。(5)有IFN-β干預(yù)的Lenti-STAT1-CC組細胞表達的PCNA蛋白量明顯低于無IFN-β干預(yù)的Len
8、ti-STAT1-CC組細胞。
4.用IFN-β干預(yù)4組H1299細胞(H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組,Lenti-STAT1-CC組)72h,發(fā)現(xiàn)在相同濃度IFN-β干預(yù)下,H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組,Lenti-STAT1-CC組細胞表達的CASPASE3蛋白量均無明顯差異。
5.不同濃度的IFN-β干預(yù)4組H1299細胞
9、(H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組,Lenti-STAT1-CC組)72h后,Lenti-STAT1-CC組生長抑制率明顯高于H1299空白組,Lenti-EGFP對照組,Lenti-STAT1組的生長抑制率(P<0.05),并隨IFN-β濃度增加而生長抑制率增高。
結(jié)論:改建型STAT1(STAT1-CC)基因可以增強IFN-β對非小細胞肺癌H1299細胞增殖的抑制作用,但是STAT
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