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文檔簡介
1、中國對蝦是我國重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種,在沿海地區(qū)海產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的經(jīng)濟地位,養(yǎng)殖對蝦不僅給人們的生活提供了美味可口的食品,而且提供了大量的就業(yè)崗位,促進了經(jīng)濟的發(fā)展。然而,自從上世紀九十年代以來,對蝦傳染性疾病的流行,特別是病毒的感染給正在蓬勃發(fā)展的對蝦養(yǎng)殖帶來了很大的損失,因而,找到一種有效的控制對蝦疾病的診斷和治療方法已經(jīng)變得越來越緊迫。 解決這一問題除了要考慮對蝦合適的養(yǎng)殖環(huán)境,對蝦的自然生態(tài)環(huán)境外,還要研究清楚對蝦的免疫
2、機理,給對蝦疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。同其他無脊椎動物一樣,對蝦中只存在先天免疫,包括細胞免疫和體液免疫。對蝦的血細胞在免疫過程中起決定性作用,主要是參與病原的吞噬,形成結節(jié)和包被。這些反應與病原微生物的識別,抗菌肽的產(chǎn)生,血淋巴的結合黑化緊密相連,從而構成了對蝦嚴謹而有效的免疫屏障。 我們利用一系列的生物化學和分子生物學方法,研究對蝦先天免疫相關基因及其功能,試圖從一定層面上了解對蝦的免疫機制,為對蝦疾病的防治提供理論依據(jù)
3、,同時為整個生物界免疫系統(tǒng)的研究提供一定的信息。 本論文主要是報道了中國對蝦兩個免疫相關基因:C-型凝集素(C-type lectin)和血小板反應素(TSP)的分子克隆和功能分析,主要結果如下: 1.中國對蝦C-型凝集素的克隆和功能研究 凝集素通過對病原微生物細胞表面的糖分子的識別,可以區(qū)分“非己”的物質,在生物的免疫應答中起重要作用。我們從中國對蝦中得到一種新型的凝集素,命名為Fc-lectin,通過功能域
4、的預測和分析發(fā)現(xiàn),它含有糖分子識別結構域(carbohydrate-recognition domains,CRDs),因此,它是一種C-型凝集素。Fc-lectin基因全長為571bp,開放閱讀框(ORF)為477bp,編碼159個氨基酸,其氨基酸序列中含 有CELECT 或稱糖基識別結構域。通過與其他動物的凝集素序列比對發(fā)現(xiàn),F(xiàn)e-Ictin的CELECT結構域與其它物種的相似性很低,即使與來自另一種對蝦(Penaeus m
5、onodon)的凝集素(PmAV)比較,其相似性也只有0.289. 半定量PCR(RT-PCR)顯示,F(xiàn)c-lectin在正常對蝦和刺激對蝦的肝胰腺,刺激對蝦的胃中有表達,在肝胰腺中,刺激對蝦Fc-lectin的表達量遠遠高于正常對蝦,而在正常對蝦的胃中沒有表達,因此推斷,其在對蝦的肝胰腺組織組成性表達,但刺激后表達上調,在胃組織是誘導表達。 肝胰腺組織原位雜交和熒光免疫組化的結果顯示Fc-Iectin在刺激對蝦的
6、肝胰腺表達量上調,這個結果與半定量PCR的結果是一致的,不同組織Westen Blotting的結果顯示Fc-lectin在刺激對蝦的肝胰腺和胃中有雜交信號,這個結果也與半定量PCR的結果一致,因此推斷Fc-lectin在中國對蝦防御病原微生物的過程中有重要作用。 構建了Fc-lec-pEr3a(+)重組質粒,轉化大腸桿菌BL21,獲得高表達量的重組蛋白,通過管碟法(Oxford cup)和液體抑制實驗等方法測試重組蛋白的抑菌活
7、性和最小抑菌濃度(MIC),發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌和真菌的抑菌能力較強,對革蘭氏陰性菌有一定的抑菌能力。細菌結合試驗發(fā)現(xiàn)Fc-lectin、可以結合巨大芽孢桿菌,蘇蕓金芽胞桿菌,滕黃微球菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,以及革蘭氏陰性菌,大腸桿菌。而不結合革蘭氏陽性菌,枯草桿菌和革蘭氏陰性菌克雷伯士氏肺炎桿菌。 2.中國對蝦血小板凝集素(TsP)的克隆和表達研究 血小板反應素(TSPs)是一個多結構域的鈣離子結合細胞外糖
8、蛋白。其結構和功能已經(jīng)在脊椎動物上進行了廣泛的研究,到現(xiàn)在為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TSPs家族至少包括五個同源基因。其中TSP-1/2/5研究的比較深入,它們在血小板聚合,炎癥反應中有重要作用。同時它可以調節(jié)傷口愈合和腫瘤生長的細胞分化,因此也被看成一種抑癌基因。 我們從中國對蝦血細胞抑制消減雜交(SSH)文庫中獲得數(shù)段血小板反應素的cDNA片斷,通過3’和5’末端快速擴增(3’RACE and 5’RACE)得到血小板反應素的全長序列,命
9、名為Fc-TSP。該基因全長共2908bp,其開放閱讀框編碼938個氨基酸序列。中國對蝦血小板反應素主要包含幾丁質結合(ChtBD2),外皮生長因子 (EGF),TSP-3功能域和其特征性功能域TSP-C,其與日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus)三個血小板反應素基因的相似性分別為:46.3%,46.9%和51.9%。 通過組織原位雜交,Northern blot,半定量PCR(RT-PCR)對正常和刺激的中國
10、對蝦血小板反應素的表達和組織分布進行了研究,Northern blot顯示其在正常和刺激對蝦的血細胞,心臟,中腸和卵巢組織中有雜交信號,同時刺激組織的雜交信號相對較強。在正常對蝦的肝胰腺中沒有雜交信號,而在刺激對蝦的肝胰腺中呈現(xiàn)較強的雜交信號,這個結果與肝胰腺原位雜交的結果一致。然而半定量PCR的結果顯示血小板反應素在刺激和正常對蝦的所有組織,包括血細胞,肝胰腺,心臟,中腸,胃,鰓,卵巢和精巢都有表達。同時除了卵巢和精巢外,刺激組織的表
11、達量高于正常組織,特別是肝胰腺??梢钥闯?,在刺激對蝦的肝胰腺,血細胞,中腸,心臟和胃組織中血小板反應素的表達量上調。根據(jù)TSP的分子結構和表達模式因此推斷血小板反應素具有多種功能:(1)Fc-TSP的氨基端有三個幾丁質結構域,暗示其可能有幾丁質結合活性,可能參與幾丁質的組裝和傷口修復;(2)Fe-TSP在對蝦血細胞中上調表達,在肝胰腺中誘導表達,說明其可能與免疫防御有關;(3)Fc-TSP在卵巢中的高水平表達,暗示其可能與日本對蝦的TS
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