Akt基因治療肝硬化門靜脈高壓癥的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肝內血管阻力增加是門靜脈高壓癥發(fā)病病理生理機制的始動原因,也是導致肝硬化病人并發(fā)癥和死亡的主要原因,其阻力增加主要是肝纖維沉積和再生結節(jié)形成引起肝解剖結構異常的結果。然而近年研究已經確定增加的肝內阻力并非全是一種機械現(xiàn)象,不同的血管活性物質如NO等在肝硬化門靜脈高壓癥肝內阻力的發(fā)展中起重要作用;實驗研究業(yè)已證實在肝硬化肝內eNOS酶活性下調和NO合成產量減少,繼而進一步增加肝內血管阻力。實驗證實絲蘇氨酸激酶Akt是eNOS酶上游重

2、要的激活劑,但其在肝硬化門靜脈高壓癥中的潛在作用尚不清楚。因此,本實驗的目的是檢測研究在肝硬化時肝內是否存在Akt活化受損,以及這一現(xiàn)象與門靜脈高壓癥相關的NO合成產量減少有著怎樣的關系。 方法:采用四氯化碳(CCl4)復合法誘導制備SD大鼠肝硬化實驗動物模型;應用AdMax系統(tǒng),以細胞內同源重組構建攜帶目的基因活化Akt的重組復制缺陷型腺病毒載體(Ad-myr-Akt);以編碼myr-Akt或EGFP的重組腺病毒轉移方法研究蛋

3、白激酶Akt在肝硬化實驗大鼠肝內的作用效應;Westernblot法檢測肝組織Akt和eNOS蛋白含量和磷酸化狀態(tài);硝酸還原酶法檢測肝組織NO含量;多普勒超聲測定實驗大鼠門靜脈內徑、最大流速和流量,置管測定門靜脈壓力(PP)、平均動脈壓(MAP)和心率(HR);采用LX20生化自動分析儀檢測肝酶學指標及血清白蛋白;HE染色切片做組織學檢查;熒光顯微鏡觀察并檢測EGFP的表達強度。 結果: 1、本研究成功制備64只SD大鼠

4、肝硬化實驗模型和成功構建攜帶myr-Akt基因滴度為5.5×1011vp/ml的新型重組腺病毒(Ad-myr-Akt)。 2、肝硬化實驗動物模型肝內顯示Akt和eNOS蛋白表達與正常大鼠一致,但p-Akt和p-eNOS蛋白表達均顯著下調(即Akt和eNOS酶磷酸化受損)。 3、腺病毒載體介導的myr-Akt(Ad-myr-Akt)基因轉移實驗顯示肝硬化大鼠肝內eNOS酶活性恢復和NO產量增加,3天后即檢測到實驗大鼠門靜脈

5、壓力的恢復和改善其血流動力;與此對照,編碼EGFP的腺病毒Ad-EGFP轉入或生理鹽水注射的實驗大鼠肝內未產生任何類似效應。 4、Ad-myr-Akt具有高度的肝靶向性,經靜脈途徑注入可在實驗大鼠肝內有效表達,且在30天內仍可見到這種效應。 5、與注入生理鹽水的肝硬化大鼠比較,轉入編碼myr-Akt基因或EGFP的腺病毒肝硬化大鼠未見ALB、ALT和AST的顯著升高;腺病毒載體Ad-5可導致正常大鼠輕微的肝損害,表現(xiàn)為肝

6、酶學指標(ALT和AST)一過性升高;myr-Akt基因轉移方法改善CCl4延長誘導的肝硬化大鼠30天生存率。 結論:肝硬化大鼠肝內Akt蛋白活化作用受損;經靜脈途徑注射編碼myr-Akt基因片段的重組腺病毒Ad-myr-Akt能在實驗大鼠肝內有效表達Akt蛋白;Akt基因轉移方法能恢復肝硬化動物肝內e-NOS酶活性和增加肝內NO產量,繼而使門靜脈壓力恢復正常和改善門靜脈血流動力。綜上所有數(shù)據(jù)提示Akt基因轉移方法可能成為未來臨

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