脂蛋白脂酶在人系膜細胞攝取極低密度脂蛋白中作用的探討.pdf

1、背景：高脂血癥能加速腎臟病進展的觀點已被越來越多的學者所證實，但大多研究主要集中在高膽固醇血癥與腎功能損害的關系。近年來有證據(jù)提示極低密度脂蛋白(verylow-densitylipoprotein，VLDL)可能參與腎小球硬化的發(fā)病過程中。脂質(zhì)積聚和泡沫細胞形成被認為是脂質(zhì)介導的腎小球和小管間質(zhì)損害的特征。體外實驗證實VLDL可誘導系膜細胞變?yōu)榕菽毎Ｈ欢鳹LDL誘導系膜細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚及導致腎損害的機制目前還不是很清楚。有研究顯示表

2、達在動脈壁的脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase，LPL)可通過其酶解作用和分子橋作用促進富含甘油三酯的脂蛋白的攝取，促進動脈粥樣硬化的形成。腎小球系膜細胞也可表達脂蛋白脂酶，但關于它在腎臟的病理生理作用罕有研究。從人類和動物實驗的許多觀察強烈提示脂質(zhì)介導的腎損害的發(fā)病機制與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有許多相似之處，那么在腎小球系膜區(qū)表達的LPL能否發(fā)揮類似的作用促進脂質(zhì)腎損害的進展值得探討。本研究旨在探討LPL在人系膜細胞攝取V

3、LDL中的作用及可能的機制；并進一步觀察與此相關的一些病理生理效應，就LPL在VLDL介導。腎損害中的作用機制進行探討。 方法：本研究使用人腎小球系膜細胞系(HMCLs)為研究對象。 1、LPL在系膜細胞攝取VLDL中的作用通過過表達和抑制兩方面的實驗進行探討： (1)將攜帶野生型人LPL基因(hLPLwt)，無活性的突變型人LPL基因(hLPL194)和對照人堿性磷酸酶基因(hAP)的重組腺病毒轉染人腎小球系膜

4、細胞(HMCLs)，建立高表達活性型和非活性型脂蛋白脂酶的HMCLs。 (2)orlistat(奧利司他)是一種內(nèi)源性LPL脂酶活性的抑制劑，用于LPL酶活性阻斷試驗。Heparinase(肝素酶)是一類能特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，能阻斷LPL分子橋作用的發(fā)揮?？筁DLr和LRP抗體被用于封閉脂蛋白受體。 (3)RT-PCR、細胞免疫化學和放射性同位素脂質(zhì)體底物法分別檢測LPLmRNA、蛋白和酶活性的水平；油

5、紅O染色和酶法分別定性和定量檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；GPOTrinder法檢測細胞上清中甘油的含量。 2、LPL在VLDL誘導的系膜細胞損傷中作用的探討： (1)LPL的過表達和抑制通過上述類似的方法實現(xiàn)。 (2)MTT法檢測VLDL對HMCLs增殖的影響；實時熒光定量RT-PCR和ELISA法檢測HMCLsMCP-1mRNA和蛋白表達的水平；通過HMCLs在高VLDL刺激后與THP-1單核細胞的共孵育，檢測了單

6、核細胞的趨化情況。 結果 1、LPL在系膜細胞攝取VLDL中的作用： (1)VLDL能誘導系膜細胞轉變?yōu)榕菽毎?，且在一定范圍?nèi)具有時間和濃度依賴性。在此種條件下，細胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)以甘油三酯為主。 (2)人腎小球系膜細胞可表達脂蛋白脂酶，并具有活性。 (3)活性型和非活性型LPL過表達實驗顯示：①三種重組腺病毒感染HMCLs，LPL活性檢測顯示：感染Ad-hLPLwt的HMCLs細胞上清液中LPL

7、活性較對照組明顯升高(40.5±0.57U/Lversus1.35±0.15U/L，P＜0.01)，而Ad-hLPL194組LPL活性與對照組無顯著差異(1.48±0.12U/Lversus1.35±0.15U/L，P＞0.05)。本結果說明HMCLs能被重組腺病毒感染并有效表達LPL。②重組腺病毒感染的HMCLs孵育在高VLDL(40μg/ml)環(huán)境中6小時后，油紅0染色顯示：對照組細胞內(nèi)幾乎見不到紅染的脂質(zhì)顆粒沉積，而Ad-hLPL

8、wt組細胞內(nèi)可見許多粗大紅色顆粒，Ad-hLPL194組細胞內(nèi)僅見一些散在細小紅色脂質(zhì)顆粒沉積。酶法分析示Ad-hLPLwt組和Ad-hLPL194組細胞內(nèi)積聚的甘油三酯較對照組明顯增多(109.11±5.01μg/mgproteinand36.33±2.64μg/mgproteinversus23.98±3.23μg/mgprotein，P＜0.01andP＜0.05)，三組的細胞內(nèi)膽固醇成分無顯著差異(P＞0.05)。③三組細胞上清

9、中甘油的測定顯示Ad-hLPLwt組細胞上清中甘油含量較Ad-hAP對照組明顯增多(P＜0.01)，而Ad-hLPL194組和Ad-hAP對照組細胞上清中甘油含量無明顯差別。 (4)LPL酶活性阻斷試驗顯示：①Orlistat劑量(0.1-10μM)依賴性地抑制了系膜細胞LPL的活性。②Orlistat劑量依賴性地抑制了VLDL誘導的細胞內(nèi)甘油三酯的積聚。10μMOrlistat組細胞內(nèi)甘油三酯含量較對照組明顯下降(34.671

10、22±0.8934μg/mgproteinversus84.4054±1.7319μg/mgprotein，P＜0.01)。③Orlistat劑量依賴性地減少了細胞上清中甘油的含量。 (5)LPL分子橋阻斷試驗顯示：預孵育heparinase的HMCLs組與對照組比較，在較高的VLDL刺激時，輕度減少了細胞內(nèi)甘油三酯的積聚。LDLr和LRP的封閉未明顯減少VLDL誘導的細胞內(nèi)甘油三酯的積聚。 2、LPL在VLDL誘導的系

11、膜細胞損傷中作用的探討： (1)在一定范圍內(nèi)，VLDL可時間劑量依賴性地促進系膜細胞的增殖和上調(diào)系膜細胞MCP-1的表達，繼而增加系膜細胞對THP-1單核細胞的趨化。 (2)LPL過表達實驗顯示：①相同條件的脂質(zhì)處理后，Ad-hLPLwt組細胞上清較對照組對HMCLs的增殖作用明顯增強(0.2282±0.0168versus0.1805±0.0254，P＜0.05)，Ad-hLPL194組和Ad-hAP組之間比較無顯著差

12、異(0.1825±0.0298versus0.1805±0.0254，P=0.051)。②與Ad-hAP對照組相比，Ad-hLPLwt組細胞MCP-1mRNA表達上調(diào)39％(P＜0.05)，蛋白表達也明顯上調(diào)(為對照的2.18倍，P＜0.01)。Ad-hLPLwt組對THP-1單核細胞的趨化能力最強，為對照組的1.69倍(P＜0.05)。Ad-hLPL194組和Ad-hAP組兩者之間無顯著差異。 (3)LPL酶活性阻斷試驗顯示：

13、①HMCLs在100μg/mlVLDL孵育24h，orlistat可劑量依賴性地抑制VLDL對HMCLs細胞的增殖效應，10μM組與DMSO對照組相比，系膜細胞增殖下降30％(P＜0.05)。②Orlistat可劑量依賴性地抑制VLDL刺激的HMCLs細胞MCP-1mRNA表達和蛋白的分泌。 (4)VLDL能時間(0-16h)和劑量(0-100μg/ml)依賴性地輕度上調(diào)系膜細胞LPL的表達。 結論 (1)VLD

14、L能誘導系膜細胞轉變?yōu)榕菽毎?，且具有時間和濃度依賴性。在此種條件下，細胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)以甘油三酯為主。 (2)人腎小球系膜細胞可表達脂蛋白脂酶，并具有活性。 (3)LPL在人系膜細胞攝取VLDL的過程中具有重要作用，其中酶的活性是主要方面。 (4)VLDL在一定范圍內(nèi)能時間劑量依賴性地刺激系膜細胞增殖和MCP-1上調(diào)，在這一過程中LPL可能發(fā)揮著重要作用。 (5)VLDL在一定范圍內(nèi)能時間劑量依賴性地輕度