MiR-494通過轉錄因子E2F1調控肺癌細胞周期的研究.pdf

1、目的：構建miR-494慢病毒表達載體及探討miR-494對肺癌細胞株的增殖、侵襲、遷移等功能研究以及與E2F1的調控關系。
　　 方法：⑴根據(jù)GenBank提供的miR-494基因的序列，設計一對含有BamH/XhoⅠ酶切位點特異性引物，用PCR法擴增目的基因的片段，目的基因同源重組入表達載體，轉化到大腸桿菌E.coli.DH5α中擴增，挑取平板上長出的轉化子進行菌落PCR鑒定，接種陽性克隆并進行序列測定，測序沒有問題的，再接

2、種抽提質粒。之后分別用三種質粒（重組質粒:pNL-EGFP/CMV/WPREdU3;包裝質粒:pCD/NL-BH*DDD;膜蛋白表達質粒: pLTR-G）進行慢病毒的包裝。命名為:pGIPZ-miR-494-eGFP，空載的命名為:pGIPZ-eGFP。并進行慢病毒的濃縮及純化，最后進行病毒滴度的測定。將慢病毒顆粒感染A549細胞，并將實驗的細胞分為三個組，帶有目的基因的miR-494組，帶有空載病毒的NC組，和不感染病毒的CON組，將

3、3組細胞進行提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA。以各組cDNA為模板，利用兩步法進行Real-Time PCR來檢測感染的效率。⑵運用細胞平板克隆形成實驗了解細胞增殖的能力，運用transwell了解細胞的遷移能力。⑶通過染色質免疫共沉淀(chip)實驗驗證兩者間是否存在調控關系。
　　 結果：①目的基因與慢病毒載體連接成功。共轉染293T細胞包裝病毒與濃縮后滴度達1.02*108TU/ml，并轉染到肺腺癌細胞株A549上，利用

4、流式細胞儀分選出的綠色熒光細胞，通過Real-Time PCR檢測結果顯示miR-494慢病毒表達載體感染的A549細胞高于對照組達10倍以上。②細胞平板克隆結果顯示:干擾的細胞克隆形成能力較空載對照單克隆細胞弱，表明miR-494過表達的A549細胞體外增殖能力減弱。和空白對照與空載細胞在克隆形成率[58.00％±4.96）和（60.50％±5.35）]相比，干擾的A549細胞的克隆形成率明顯減少（28.00％±3.62）。差異有統(tǒng)計

5、學意義(P＜0.05)。③Transwel小室實驗結果顯示:三組細胞運動能力的差異具有顯著性。與未干擾的A549細胞和空載細胞相比，干擾的A549細胞穿過膜的細胞數(shù)顯著減少，其運動能力明顯降低（138.3±10.41 vs133.3±5.77 vs77.3±3.06;P＜0.05）。④Chip實驗結果顯示:在A549細胞中，E2F1通過與預測的四個結合位點從而調控mir-494的啟動子區(qū)，從而對mir-494進行調控。
　　 結