重組腺病毒介導的可調控人胰島素基因治療Ⅰ型糖尿病的實驗研究.pdf

1、近年來，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢，在我國已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾患之后第三位重要的慢性非傳染性疾病。然而，現有的各種糖尿病的治療措施，均有一定的不足和局限性。隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，基因治療為糖尿病治療開辟了一條嶄新的途徑。胰島素基因治療可分為生殖細胞基因治療和體細胞基因治療兩大類，而體細胞基因治療從方法上又可分為回體轉移和體內直接轉移兩種。由于技術上及倫理學上的障礙，生殖細胞基因治療目前只能用于實驗研究，不能

2、作為用于人類的一條治療途徑。而回體轉移法選用的靶細胞均是永生化細胞系，移植體內后可能形成移植瘤，阻礙了其進一步的臨床應用。體內直接基因轉移是基因治療糖尿病的最終目的。目前，利用基因轉移載體將胰島素基因直接導入體內并使其表達成熟的胰島素已不是一件困難的事情，關鍵是在體細胞(非B細胞)中建立受葡萄糖濃度調控的胰島素分泌功能。另一方面，基因治療中還有一個不可忽視的關鍵問題就是轉移載體的安全性和轉染效率。目前，基因治療中常用的轉移系統(tǒng)主要包括非

3、病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)兩大類。非病毒載體系統(tǒng)雖然具有制備簡便，免疫原性較低，安全性較高等優(yōu)點，但其轉染效率低下、表達時間較短，很難進一步應用于臨床實驗。而病毒載體系統(tǒng)，尤其是重組腺病毒，因其轉染效率高、宿主范圍廣泛、安全性高、易于制備較高滴度等優(yōu)點，正被越來越多地應用于體外的基因轉導和體內的基因治療，是目前最常用的基因轉移載體之一。我們構建了攜帶葡萄糖依賴性促胰島素多肽(Glucose-dependentinsulinotropic

4、polypeptide，GIP)啟動子控制下人胰島素基因的重組腺病毒，體外和體內轉染胃腸道K細胞，使K細胞獲得受葡萄糖濃度調控的胰島素表達、分泌功能，探索一條胰島素轉基因治療的有效途徑，為糖尿病的基因治療走向臨床提供實驗研究基礎。 方法：我們首先采用細胞內同源重組法構建攜帶GIP啟動子控制下的人胰島素基因的非增殖型腺病毒(Ad．GIP-hlns)，通過擴增和純化獲得病毒濃縮液。在體外實驗中，將病毒以不同的感染復數(Multipl

5、icityOfInfection，MOI)轉染STC．1細胞，檢測病毒的感染能力；以放射免疫法測定MOI=100時重組腺病毒轉染不同細胞、在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)液中胰島素的含量，來檢測GIP啟動子的細胞特異性與葡萄糖反應性。通過RT-PCR檢測細胞中人胰島素基因mRNA的轉錄，采用免疫組化與雙重免疫熒光定性檢測細胞中胰島素與GIP的共表達。然后，通過腸系膜上動脈將病毒導入糖尿病大鼠體內，觀察病毒轉染后糖尿病大鼠血糖、胰島素分泌及體重的變

6、化。 結果：經PCR鑒定，證實我們成功構建了含有目的基因的重組腺病毒Ad．GIP-hIns。體外實驗證實腺病毒對STC-1細胞有較強的感染能力，且以MOI值為100時轉染效率最佳。以重組病毒轉染不同細胞，結果表明僅在STC．1細胞內有胰島素的表達，且在轉染后第3天就進入表達高峰，一直持續(xù)至第七天；同時發(fā)現胰島素的表達量隨葡萄糖濃度升高而增加，但差別無統(tǒng)計學意義。 RT-PCR和免疫組化分別從RNA與細胞內蛋白水平驗證了轉

7、染后細胞內有胰島素基因的轉錄與表達。經腸系膜上動脈注入重組病毒，可以成功地轉染糖尿病大鼠腸道的K細胞，使其產生血糖可調節(jié)性胰島素分泌，明顯改善了糖尿病大鼠的糖耐量情況，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時間內得到一定水平的控制。 結論：我們構建的攜帶目的基因的重組腺病毒，體外和體外實驗均可以轉染胃腸道K細胞，使其表達胰島素，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時間內得到一定水平的控制，為將來體內人胰島素基因治療糖尿病提供了堅實的理論基礎和實驗