PI3K在ALS萎縮肌纖維中表達的意義.pdf

1、目的：肌萎縮側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，主要累及脊髓前角、腦干后組運動神經(jīng)核以及錐體束，以上、下運動神經(jīng)元同時受損為特征。臨床常以單肢遠端肌無力、萎縮為首發(fā)癥狀，逐漸累及其他肢體。上運動神經(jīng)元受累表現(xiàn)為腱反射活躍、病理反射陽性：下運動神經(jīng)元受累表現(xiàn)為遠端肌無力、萎縮。感覺和括約肌功能一般不受影響。近年來ALS確切發(fā)病機制未明確，目前研究認為發(fā)病機制相關因素如下：遺

2、傳因子突變；興奮性氨基酸毒性增高；神經(jīng)絲（neurofilament，NF）異常聚集；線粒體功能障礙；神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factor，NTF）失調(diào)；蛋白質(zhì)聚集體等。眾多研究發(fā)現(xiàn)ALS發(fā)病與運動神經(jīng)元凋亡有關，本研究主要目的是探討ALS肌纖維萎縮與凋亡之間的關系。
　　 運動神經(jīng)元病變導致骨骼肌失神經(jīng)支配，出現(xiàn)特征性病理變化-小角化肌纖維、肌纖維肥大、分裂肌纖維、 萎縮肌纖維成小群分部、核聚集、靶狀纖維、RR

3、F（Ragged Red Fiber）、肌纖維類型群化或肌纖維優(yōu)勢。大量的國內(nèi)外研究證實失神經(jīng)支配后骨骼肌肌纖維與細胞凋亡相關。ALS肌纖維中存在RRF，肌膜下線粒體聚集，顯著的COX、SDH、NADH-TR酶學改變，說明ALS存在線粒體功能異常及氧化損傷現(xiàn)象，由此推測ALS線粒體功能障礙引起肌細胞凋亡可能是肌纖維萎縮的病理、生理學基礎。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是磷脂激酶

4、家族中的一個重要成員，PI3K活化產(chǎn)生的細胞膜類脂產(chǎn)物3，4.二磷酸磷脂酰肌醇[PI（3，4）P2]和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI（3，4，5）P3]是細胞內(nèi)重要的第二信使，它們能激活下游一系列蛋白激酶如Akt/PKB（protein kinase B，蛋白激酶B），PKC（protein kinase C，蛋白激酶C）和PKA（protein kinase A，蛋白激酶A），由此導致信號的進一步轉(zhuǎn)導，參與細胞的增殖、分化、凋亡和

5、葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。
　　 本研究通過對ALS活檢骨骼肌組織化學及酶學染色病理分析；ALS肌纖維透射電鏡超微結構變化分析；抗-P13K免疫組織化學染色肌纖維表達情況的分析，探討ALS肌纖維的凋亡機制。
　　 方法：選擇31例ALS患者作為研究對象，診斷標準符合2001年中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會ALS的診斷標準——參照世界神經(jīng)病學聯(lián)盟（World Federation of Neurology，WFN）的診斷標準

6、。全部患者行開放式肱二頭肌活檢，冰凍切片，組織化學及酶學染色（HE、GT、COX、NADH-TR、SDH、ATPase），抗-PI3K、NCAM單克隆抗體免疫組織化學染色，光學顯微鏡下分析細胞形態(tài)學改變及PI3K、NCAM在肌纖維的表達。部分患者活檢骨骼肌經(jīng)處理后（方法詳見研究論文）透射電鏡下分析肌纖維超微結構變化。
　　 結果：
　　 1.ALS骨骼肌組織化學及酶學染色病理分析：
　　 ALS患者活檢骨骼肌病理

7、分析共同特點如下：明顯肌纖維大小不一，變性肌纖維散在，壞死、再生肌纖維少見；大量小角化肌纖維散在于肌束間，萎縮肌纖維群化，典型的核聚集現(xiàn)象，常見肌纖維肥大、分裂現(xiàn)象，結締組織不同程度增生；部分患者改良GT染色可見肌膜下嗜堿性顆粒聚集，偶見RRF；ATPase染色肌纖維類型群化或優(yōu)勢；NADH-TR、SDH、COX酶染色胞漿中局灶性酶活性減低，可見典型靶狀纖維、蟲噬纖維。
　　 2.ALS骨骼肌免疫組織化學染色病理分析：
　

8、　 抗-PI3K、NCAM（neural cell adhesion molecule，神經(jīng)細胞粘附分子）單克隆抗體免疫組化染色，分析PI3K、NCZM在ALS肌纖維中表達，PI3K在萎縮肌纖維膜上呈陽性表達，而NCAM在萎縮肌纖維中陰性表達。
　　 3.ALS骨骼肌電鏡下超微結構病理改變分析：
　　 透射電鏡超微結構觀察：變性肌纖維中肌節(jié)結構不清，粗細肌絲排列無序，局部肌絲呈灶狀溶解，Z線呈輕度水紋狀或排列不齊，肌原

9、纖維間充填大量糖原顆粒和變性線粒體，線粒體腫脹、膜嵴融合，可見空泡化線粒體。
　　 結論：
　　 1.ALS活檢骨骼肌病理分析：肌纖維膜下線粒體聚集、RRF，氧化酶（COX、SDH、NADH-TR）活性異常，而這些酶在細胞氧化過程中均為線粒體呼吸酶系的關鍵酶，提示ALS肌纖維中的線粒體氧化代謝障礙。
　　 2.PI3K是PI3K/Akt凋亡途徑重要信號，而PI3K在ALS萎縮肌纖維膜上顯著表達，NCAM在萎縮肌纖