豚鼠離焦性近視眼鞏膜Ⅰ型膠原、整合素α2、β1的表達(dá)及bFGF對(duì)近視形成的抑制作用.pdf

1、目的：
　　近年來，隨著青少年近視眼發(fā)病率的不斷升高，近視眼的預(yù)防和治療治引起了全世界廣泛的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性近視眼模型的建立，為近視眼的研究提供了有效的手段。用凹透鏡模擬的視環(huán)境的改變可以短期內(nèi)造成動(dòng)物眼軸伸長(zhǎng)，近視屈光度增加，建立光學(xué)離焦性近視眼模型，這種離焦性近視眼模型與人類近視眼的發(fā)病更加相似。研究表明，眼軸的伸長(zhǎng)是鞏膜組織的異常重塑的結(jié)果，因此，重視對(duì)實(shí)驗(yàn)性近視眼鞏膜組織的研究，并找到有效的抑制細(xì)胞外基質(zhì)異常重塑的手段，是

2、近視眼防治切實(shí)可行的方向。Ⅰ型膠原是鞏膜組織的最主要成分，以往對(duì)其研究多集中在合成和降解的改變，而另一種和膠原密切相關(guān)的基質(zhì)成分——膠原結(jié)合整合素受體的研究少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立豚鼠離焦性近視眼模型，檢測(cè)整合素在鞏膜的表達(dá)及在近視眼是否存在差異，并觀察球周注射堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)近視形成的影響，探討近視眼鞏膜重塑的發(fā)病機(jī)制及防治手段。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　建立凹透鏡誘導(dǎo)的豚鼠離焦性近視眼模型，觀察視環(huán)境的改

3、變即離焦與近視形成后的短期恢復(fù)對(duì)豚鼠屈光狀態(tài)、眼軸長(zhǎng)度的影響，以及鞏膜組織形態(tài)學(xué)改變。
　　40只3周齡豚鼠，雙眼屈光檢查無近視狀態(tài)，無明顯屈光參差。隨機(jī)分組:①光學(xué)離焦組:16只，右眼戴-7D鏡片，為離焦組實(shí)驗(yàn)眼（16眼），戴鏡14天;左眼不戴鏡，自身對(duì)照眼（16眼）。②離焦后恢復(fù)組:16只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼(16眼)，戴鏡14天后，去除右眼鏡片，自然視環(huán)境下飼養(yǎng)2天;左眼為自身對(duì)照眼（16眼）。③空白對(duì)照組:8只正常豚鼠，共16眼

4、，不做任何處理，和實(shí)驗(yàn)組同周齡。
　　實(shí)驗(yàn)開始前雙眼滴1％托吡卡胺滴眼液，待睫狀肌麻痹后，行帶狀光檢影驗(yàn)光。驗(yàn)光結(jié)束后，眼表面麻醉，使用A超儀測(cè)量雙眼眼軸長(zhǎng)度，測(cè)量從角膜頂點(diǎn)到眼球后極部玻璃體視網(wǎng)膜界面的距離。
　　PMMA鏡片放于自制黏貼式尼龍扣中，粘貼于離焦組豚鼠右眼眼前。室內(nèi)地面無限制飼養(yǎng)，光照周期約為14h/10h。14天后戴鏡豚鼠右眼去除鏡片，再次測(cè)量屈光度和眼軸長(zhǎng)度，離焦組和空白對(duì)照組豚鼠處死，取材。恢復(fù)組去除鏡

5、片后，自然環(huán)境下飼養(yǎng)2天，第三次測(cè)量屈光度和眼軸長(zhǎng)度，測(cè)量結(jié)束處死，取材。角膜緣后2mm處分割鞏膜，取后部鞏膜為檢測(cè)對(duì)象。每組中處理因素相同的眼球，隨機(jī)抽取2眼用于電鏡標(biāo)本制作，浸泡于2.5％戊二醛中固定;隨機(jī)抽取2眼用于膠原特殊染色;6眼于眼球?qū)Ｓ霉潭ㄒ褐泄潭?4小時(shí)，用于免疫組化染色;6眼迅速置于液氮罐中，用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　第一部分實(shí)驗(yàn)中各組動(dòng)物于設(shè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)間處死，每組隨機(jī)

6、抽取6份鞏膜樣本行RT-PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組后部鞏膜中Ⅰ型膠原α1(1)鏈、整合素α2、β1及ILK的mRNA水平表達(dá)，6份用于免疫組化染色，檢測(cè)整合素α2、β1及ILK在鞏膜的定位及蛋白水平的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　應(yīng)用球周注射的方法，觀察bFGF對(duì)豚鼠離焦性近視形成的抑制作用。42只3周齡三色豚鼠，隨機(jī)分為4組:A:正常對(duì)照組，6只，12眼，與各實(shí)驗(yàn)組年齡匹配的正常豚鼠。B:光學(xué)離焦組，12只，右眼戴-7D鏡片。C:光

7、學(xué)離焦+PBS組，12只，右眼戴-7D鏡片+隔日一次PBS球周注射。D:光學(xué)離焦+bFGF組，12只，右眼戴-7D鏡片+隔日bFGF球周注射。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為14天。
　　于實(shí)驗(yàn)開始前和結(jié)束時(shí)睫狀肌麻痹后行帶狀光檢影驗(yàn)光，A超儀測(cè)量雙眼眼軸長(zhǎng)度。
　　將rhbFGF溶于PBS緩沖液中，濃度為100ng/ml。C、D組豚鼠從右眼離焦的當(dāng)天開始，隔日同一時(shí)段，氯胺酮75mg/Kg股部注射輕度麻醉后，分別球周注射bFGF和PBS緩沖液5

8、0μl。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，小心剝離后部鞏膜，每組隨機(jī)各取6份用于RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原α1鏈、整合素α2、整合素β1的mRNA水平表達(dá)。6份用于WesternBlot法檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:組間差異用one wayANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn);左右眼差異應(yīng)用配對(duì)T檢驗(yàn)比較。所有數(shù)據(jù)用((x)±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

9、br>　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　實(shí)驗(yàn)前3周齡豚鼠屈光度約為+3.00D遠(yuǎn)視，眼軸約7.3mm，各組間、組內(nèi)雙眼間屈光度、眼軸長(zhǎng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　用-7D凹透鏡經(jīng)14天光學(xué)離焦可以造成豚鼠近視眼。實(shí)驗(yàn)眼呈中度近視狀態(tài)，屈光度為-3.33±0.16D，與組內(nèi)對(duì)照眼、空白對(duì)照眼比較，差異有顯著性(P＜0.01）。離焦恢復(fù)組的實(shí)驗(yàn)眼在離焦恢復(fù)2天后屈光度為-2.48±0.19D，與恢復(fù)當(dāng)天比較，屈光

10、度減少，差異有顯著性(P＜0.01）。
　　14天后，離焦組和恢復(fù)組的實(shí)驗(yàn)眼眼軸伸長(zhǎng)，與各自對(duì)照眼比較，差異有顯著性(P＜0.01）。離焦恢復(fù)組的實(shí)驗(yàn)眼去除鏡片后在正常視環(huán)境下2天，與去除離焦時(shí)(14d)眼軸比較無變化(P＞0.05）。
　　鞏膜形態(tài)學(xué)觀察見離焦性近視眼豚鼠后部鞏膜膠原纖維排列紊亂，鞏膜變薄。電鏡下膠原纖維密度減少，小直徑膠原纖維增多，成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。
　　苦味酸-天狼猩紅膠原染色顯示Ⅰ型膠原主要

11、分布于后極部，實(shí)驗(yàn)眼Ⅰ型膠原纖維密度減少，排列紊亂。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　免疫組織化學(xué)染色可見，豚鼠鞏膜組織可見整合素β1、整合素α2和ILK的蛋白表達(dá)，于扁長(zhǎng)形或梭形的成纖維細(xì)胞胞核周圍，不規(guī)則的棕黃色著色。整合素β1、整合素α2和ILK在離焦組和恢復(fù)組的實(shí)驗(yàn)眼鞏膜表達(dá)均減弱，與對(duì)照眼和正常眼比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。離焦恢復(fù)2天整合素β1、整合素α2和ILK蛋白表達(dá)較離焦組無差異。
　?、裥湍z原α1(1)

12、鏈、整合素β1、整合素α2和ILK在離焦組和恢復(fù)組的實(shí)驗(yàn)眼的mRNA水平表達(dá)下降，與自身對(duì)照眼比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)經(jīng)過2天的恢復(fù)，可見整合素Ⅰ型膠原α1(1)鏈、整合素β1、整合素α2和ILKmRNA水平表達(dá)比離焦組實(shí)驗(yàn)眼有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　14天后，光學(xué)離焦組、光學(xué)離焦+PBS組、光學(xué)離焦+bFGF組豚鼠均出現(xiàn)單眼近視，PBS注射組的實(shí)驗(yàn)眼屈光度為-3.27±0

13、.16D，眼軸長(zhǎng)度為8.00±0.02mm，光學(xué)離焦組屈光度為-3.48±0.15D，眼軸長(zhǎng)度為8.04±0.03mm，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。bFGF球周注射組的近視屈光度為-1.46±0.11D，眼軸長(zhǎng)度為7.71±0.02mm，和光學(xué)離焦組、PBS注射組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。bFGF組的Ⅰ型膠原、整合素α2、整合素β1的mRNA和蛋白水平表達(dá)較光學(xué)離焦組、PBS注射組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

14、P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、3周齡的豚鼠用-7D的凹透鏡離焦14天可成功誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)性軸性近視，實(shí)驗(yàn)眼的后極部鞏膜變薄，膠原纖維排列紊亂，間隙變大，小直經(jīng)纖維增多以及成纖維細(xì)胞的形態(tài)異常，表明實(shí)驗(yàn)性近視眼的形成是鞏膜異常重塑的過程。
　　2、離焦誘導(dǎo)近視眼形成后去除鏡片、經(jīng)過2天的恢復(fù)，近視度數(shù)下降，進(jìn)一步證實(shí)短期視環(huán)境改變即可引起屈光度變化，但眼軸長(zhǎng)度沒有改變，鞏膜重塑導(dǎo)致的眼軸伸長(zhǎng)短期內(nèi)不能恢復(fù)。
　

15、　3、豚鼠鞏膜Ⅰ型膠原主要分布于后極部，Ⅰ型膠原的改變是近視眼鞏膜重塑的重要因素。
　　4、豚鼠離焦性近視眼鞏膜內(nèi)整合素β1、整合素α2、ILKmRNA和蛋白表達(dá)水平下降，參與實(shí)驗(yàn)性近視眼鞏膜重塑過程。去除離焦恢復(fù)2天后，鞏膜內(nèi)整合素β1、整合素α2、ILKmRNA水平表達(dá)回升，表明鞏膜內(nèi)整合素β1、整合素α2、ILK是鞏膜重塑過程的早期調(diào)節(jié)因子。
　　5、外源性bFGF能夠上調(diào)豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視眼后部鞏膜Ⅰ型膠原、整合素β1、