豚鼠離焦性近視眼鞏膜Ⅰ型膠原、整合素α2、β1的表達及bFGF對近視形成的抑制作用.pdf

1、目的：
　　近年來，隨著青少年近視眼發(fā)病率的不斷升高，近視眼的預防和治療治引起了全世界廣泛的關注。動物實驗性近視眼模型的建立，為近視眼的研究提供了有效的手段。用凹透鏡模擬的視環(huán)境的改變可以短期內造成動物眼軸伸長，近視屈光度增加，建立光學離焦性近視眼模型，這種離焦性近視眼模型與人類近視眼的發(fā)病更加相似。研究表明，眼軸的伸長是鞏膜組織的異常重塑的結果，因此，重視對實驗性近視眼鞏膜組織的研究，并找到有效的抑制細胞外基質異常重塑的手段，是

2、近視眼防治切實可行的方向。Ⅰ型膠原是鞏膜組織的最主要成分，以往對其研究多集中在合成和降解的改變，而另一種和膠原密切相關的基質成分——膠原結合整合素受體的研究少有報道。本實驗建立豚鼠離焦性近視眼模型，檢測整合素在鞏膜的表達及在近視眼是否存在差異，并觀察球周注射堿性成纖維細胞生長因子對近視形成的影響，探討近視眼鞏膜重塑的發(fā)病機制及防治手段。
　　方法：
　　實驗一:
　　建立凹透鏡誘導的豚鼠離焦性近視眼模型，觀察視環(huán)境的改

3、變即離焦與近視形成后的短期恢復對豚鼠屈光狀態(tài)、眼軸長度的影響，以及鞏膜組織形態(tài)學改變。
　　40只3周齡豚鼠，雙眼屈光檢查無近視狀態(tài)，無明顯屈光參差。隨機分組:①光學離焦組:16只，右眼戴-7D鏡片，為離焦組實驗眼（16眼），戴鏡14天;左眼不戴鏡，自身對照眼（16眼）。②離焦后恢復組:16只，右眼為實驗眼(16眼)，戴鏡14天后，去除右眼鏡片，自然視環(huán)境下飼養(yǎng)2天;左眼為自身對照眼（16眼）。③空白對照組:8只正常豚鼠，共16眼

4、，不做任何處理，和實驗組同周齡。
　　實驗開始前雙眼滴1％托吡卡胺滴眼液，待睫狀肌麻痹后，行帶狀光檢影驗光。驗光結束后，眼表面麻醉，使用A超儀測量雙眼眼軸長度，測量從角膜頂點到眼球后極部玻璃體視網膜界面的距離。
　　PMMA鏡片放于自制黏貼式尼龍扣中，粘貼于離焦組豚鼠右眼眼前。室內地面無限制飼養(yǎng)，光照周期約為14h/10h。14天后戴鏡豚鼠右眼去除鏡片，再次測量屈光度和眼軸長度，離焦組和空白對照組豚鼠處死，取材。恢復組去除鏡

5、片后，自然環(huán)境下飼養(yǎng)2天，第三次測量屈光度和眼軸長度，測量結束處死，取材。角膜緣后2mm處分割鞏膜，取后部鞏膜為檢測對象。每組中處理因素相同的眼球，隨機抽取2眼用于電鏡標本制作，浸泡于2.5％戊二醛中固定;隨機抽取2眼用于膠原特殊染色;6眼于眼球專用固定液中固定24小時，用于免疫組化染色;6眼迅速置于液氮罐中，用于逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的檢測。
　　實驗二:
　　第一部分實驗中各組動物于設定實驗時間處死，每組隨機

6、抽取6份鞏膜樣本行RT-PCR法檢測各實驗組后部鞏膜中Ⅰ型膠原α1(1)鏈、整合素α2、β1及ILK的mRNA水平表達，6份用于免疫組化染色，檢測整合素α2、β1及ILK在鞏膜的定位及蛋白水平的表達。
　　實驗三:
　　應用球周注射的方法，觀察bFGF對豚鼠離焦性近視形成的抑制作用。42只3周齡三色豚鼠，隨機分為4組:A:正常對照組，6只，12眼，與各實驗組年齡匹配的正常豚鼠。B:光學離焦組，12只，右眼戴-7D鏡片。C:光

7、學離焦+PBS組，12只，右眼戴-7D鏡片+隔日一次PBS球周注射。D:光學離焦+bFGF組，12只，右眼戴-7D鏡片+隔日bFGF球周注射。實驗時間為14天。
　　于實驗開始前和結束時睫狀肌麻痹后行帶狀光檢影驗光，A超儀測量雙眼眼軸長度。
　　將rhbFGF溶于PBS緩沖液中，濃度為100ng/ml。C、D組豚鼠從右眼離焦的當天開始，隔日同一時段，氯胺酮75mg/Kg股部注射輕度麻醉后，分別球周注射bFGF和PBS緩沖液5

8、0μl。
　　實驗結束后處死動物，小心剝離后部鞏膜，每組隨機各取6份用于RT-PCR檢測Ⅰ型膠原α1鏈、整合素α2、整合素β1的mRNA水平表達。6份用于WesternBlot法檢測蛋白表達。
　　統(tǒng)計學分析:
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析:組間差異用one wayANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD法檢驗;左右眼差異應用配對T檢驗比較。所有數(shù)據用((x)±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。<

9、br>　　結果：
　　實驗一:
　　實驗前3周齡豚鼠屈光度約為+3.00D遠視，眼軸約7.3mm，各組間、組內雙眼間屈光度、眼軸長度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　用-7D凹透鏡經14天光學離焦可以造成豚鼠近視眼。實驗眼呈中度近視狀態(tài)，屈光度為-3.33±0.16D，與組內對照眼、空白對照眼比較，差異有顯著性(P＜0.01）。離焦恢復組的實驗眼在離焦恢復2天后屈光度為-2.48±0.19D，與恢復當天比較，屈光

10、度減少，差異有顯著性(P＜0.01）。
　　14天后，離焦組和恢復組的實驗眼眼軸伸長，與各自對照眼比較，差異有顯著性(P＜0.01）。離焦恢復組的實驗眼去除鏡片后在正常視環(huán)境下2天，與去除離焦時(14d)眼軸比較無變化(P＞0.05）。
　　鞏膜形態(tài)學觀察見離焦性近視眼豚鼠后部鞏膜膠原纖維排列紊亂，鞏膜變薄。電鏡下膠原纖維密度減少，小直徑膠原纖維增多，成纖維細胞形態(tài)不規(guī)則。
　　苦味酸-天狼猩紅膠原染色顯示Ⅰ型膠原主要

11、分布于后極部，實驗眼Ⅰ型膠原纖維密度減少，排列紊亂。
　　實驗二:
　　免疫組織化學染色可見，豚鼠鞏膜組織可見整合素β1、整合素α2和ILK的蛋白表達，于扁長形或梭形的成纖維細胞胞核周圍，不規(guī)則的棕黃色著色。整合素β1、整合素α2和ILK在離焦組和恢復組的實驗眼鞏膜表達均減弱，與對照眼和正常眼比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。離焦恢復2天整合素β1、整合素α2和ILK蛋白表達較離焦組無差異。
　?、裥湍z原α1(1)

12、鏈、整合素β1、整合素α2和ILK在離焦組和恢復組的實驗眼的mRNA水平表達下降，與自身對照眼比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)經過2天的恢復，可見整合素Ⅰ型膠原α1(1)鏈、整合素β1、整合素α2和ILKmRNA水平表達比離焦組實驗眼有增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　實驗三:
　　14天后，光學離焦組、光學離焦+PBS組、光學離焦+bFGF組豚鼠均出現(xiàn)單眼近視，PBS注射組的實驗眼屈光度為-3.27±0

13、.16D，眼軸長度為8.00±0.02mm，光學離焦組屈光度為-3.48±0.15D，眼軸長度為8.04±0.03mm，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。bFGF球周注射組的近視屈光度為-1.46±0.11D，眼軸長度為7.71±0.02mm，和光學離焦組、PBS注射組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。bFGF組的Ⅰ型膠原、整合素α2、整合素β1的mRNA和蛋白水平表達較光學離焦組、PBS注射組增加，差異有統(tǒng)計學意義(

14、P＜0.05)。
　　結論：
　　1、3周齡的豚鼠用-7D的凹透鏡離焦14天可成功誘導出實驗性軸性近視，實驗眼的后極部鞏膜變薄，膠原纖維排列紊亂，間隙變大，小直經纖維增多以及成纖維細胞的形態(tài)異常，表明實驗性近視眼的形成是鞏膜異常重塑的過程。
　　2、離焦誘導近視眼形成后去除鏡片、經過2天的恢復，近視度數(shù)下降，進一步證實短期視環(huán)境改變即可引起屈光度變化，但眼軸長度沒有改變，鞏膜重塑導致的眼軸伸長短期內不能恢復。
　

15、　3、豚鼠鞏膜Ⅰ型膠原主要分布于后極部，Ⅰ型膠原的改變是近視眼鞏膜重塑的重要因素。
　　4、豚鼠離焦性近視眼鞏膜內整合素β1、整合素α2、ILKmRNA和蛋白表達水平下降，參與實驗性近視眼鞏膜重塑過程。去除離焦恢復2天后，鞏膜內整合素β1、整合素α2、ILKmRNA水平表達回升，表明鞏膜內整合素β1、整合素α2、ILK是鞏膜重塑過程的早期調節(jié)因子。
　　5、外源性bFGF能夠上調豚鼠實驗性近視眼后部鞏膜Ⅰ型膠原、整合素β1、