siRNA抑制ZNF139前后人胃癌原位移植祼鼠血清差異蛋白質的篩選與鑒定.pdf

1、目的:以胃癌SGC7901細胞原位移植裸鼠模型為對象，通過熒光雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)結合液質聯(lián)用(LC-MS)鑒定技術等蛋白質組學方法研究抑制ZNF139后對胃癌原位移植裸鼠血清的影響，為ZNF139參與胃癌進展并發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標志物提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)人胃癌細胞株SGC7901，針對ZNF139基因設計siRNA，構建siRNA-ZNF139表達質粒。通過X-tremeGENEHP轉染試劑

2、介導轉染胃癌細胞株SGC7901，并通過qRT-PCR檢測細胞中ZNF139mRNA的相對表達量，計算其抑制效率。
　　 2.以siRNA-ZNF139質粒和陰性對照質粒轉染胃癌細胞SGC7901，G418篩選出穩(wěn)定轉染細胞和普通的SGC7901細胞分別注入裸鼠皮下。每4天測量皮下瘤長短徑，待皮下瘤直徑約1.0cm左右時取出，剪成大小約1mm3瘤塊進行鼠間傳代，將第六代皮下瘤應用OB生物膠粘貼法進行原位移植。
　　 3.

3、用血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒去除胃癌原位移植裸鼠血清中高豐度蛋白，利用SDS-PAGE檢測去除高豐度蛋白前后蛋白的完整性及血清蛋白的變化。
　　 4.采用2D-DIGE技術分離siRNA-ZNF139干擾前后胃癌原位移植裸鼠血清蛋白。應用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取差異明顯的蛋白點并利用Ettanspotpicker挖取膠中的差異蛋白點，膠內酶解后利用LC-MS進行分析。再應用

4、BioWorks軟件中的SEQUEST運算方法進行數(shù)據(jù)庫檢索。
　　 5.將已鑒定的部分差異蛋白通過蛋白質印記(Westernblot)從蛋白質水平進行驗證，檢測是否與蛋白質組學結果一致。
　　 結果:
　　 1.不同濃度siRNA-ZNF139質粒轉染胃癌SGC7901細胞后ZNF139mRNA表達的變化
　　 qRT-PCR檢測顯示在0μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、

5、1.0μg/ml重組質粒轉染的胃癌SGC7901細胞中ZNF139mRNA相對表達量分別為1.003±0.0970,0.7517±0.0436,0.3611±0.0445,0.1622±0.0181,0.5531±0.0377，統(tǒng)計分析顯示與0μg/ml組相比各組有顯著差異（P＜0.05），其中以0.8μg/ml組抑制效率最高，為83.83％。
　　 2.siRNA抑制ZNF139對裸鼠皮下瘤生長的影響
　　 接種胃癌細

6、胞SGC7901六天后空白組和陰性組裸鼠均長出皮下瘤，十天后實驗組裸鼠可見皮下瘤，之后瘤體不斷增大。統(tǒng)計學分析表明空白組皮下瘤體積比陰性組略大，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），siRNA-ZNF139組皮下瘤體積明顯小于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 3.胃癌原位移植裸鼠模型的形態(tài)觀察
　　 陰性組1只裸鼠因麻醉過量死亡，空白組和siRNA-ZNF139組各1只裸鼠于術后2天死亡，接種2周后15

7、只存活裸鼠上腹部均可觸及明顯腫塊，之后腫塊不斷增大?？瞻捉M原位瘤體積比陰性組略大，差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，siRNA-ZNF139組裸鼠瘤體體積明顯小于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。原位移植瘤經HE染色組織病理學檢查均可見核大深染的腫瘤細胞，證實為胃癌，原位成瘤率100％。
　　 4.血清蛋白完整性檢測及純化
　　 SDS-PAGE分離血清蛋白后經考馬斯亮藍染色顯示各組血清蛋白無明顯降解，用血清白

8、蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒處理后的裸鼠血清中高豐度蛋白含量明顯降低，低豐度蛋白條帶更明顯。
　　 5.siRNA抑制ZNF139前后胃癌原位移植裸鼠血清差異蛋白的篩選與鑒定
　　 在2D-DIGE圖譜上分離到的蛋白質點平均為4487±46個，匹配率為83.1％，說明雙向電泳技術分離血清蛋白質組可得到較高的重復性。應用DeCyderDifferentialAnalysisSoftware選取7個差異明顯的蛋白點。結合LC-

9、MS鑒定出5種蛋白質（APOE、KNG1、α2-MG、mTERF、DIXDCl），其中APOE、KNG1在siRNA-ZNF139組的胃癌血清中表達下調，α2-MG、mTERF、DIXDC1表達上調。
　　 6.siRNA抑制ZNF139對胃癌原位移植裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF、ZNF139蛋白表達的影響
　　 應用Westernblot法對各實驗裸鼠血清中APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表達

10、進行了驗證。統(tǒng)計學分析表明空白組與陰性組的APOE、KNG1、mTERF和ZNF139的表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，與兩對照組相比，siRNA-ZNF139組的APOE、KNG1和ZNF139的表達量顯著降低，而mTERF的表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與蛋白質組學結果一致。
　　 結論:
　　 1.siRNA-ZNF139質?？筛咝б种芞NF139基因的表達。
　　 2.siR

11、NA-ZNF139質?？梢种莆赴┞闶笃は铝黾霸灰浦擦龅纳L。
　　 3.改良后的組織塊OB生物膠粘貼法建立的人胃癌裸鼠原位移植模型可近似模擬胃癌在人體內的增殖、侵襲、轉移等生物學行為，而且操作簡單、成瘤率高，便于觀察、測量和干預，可作為目前較理想的研究胃癌的實驗模型。
　　 4.去除血清中白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白為血清蛋白質組學研究奠定了基礎。
　　 5.DIGE技術具有較高的準確性、重復性和靈敏度，結合