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文檔簡介
1、目的
在我國肺癌總體發(fā)病率已位居惡性腫瘤第一位,肺癌惡性程度高,治療效果不是很理想,5年生存率不高。順鉑是化療常用藥物之一,屬于細胞周期非特異性藥物,導致DNA復制障礙,從而抑制腫瘤細胞分裂。SIRT1屬于Ⅲ類組蛋白去乙酰酶,在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,對于肺癌細胞的化療敏感性可能也有重要影響。EX527是新型的一種特異性的高效的SIRT1抑制劑,本實驗試圖在體外實驗中觀察EX527對人肺癌A549細胞順鉑敏感性的作用,
2、并觀察在這過程中SIRT1及其靶分子蛋白的變化。
方法
1.采用MTT法測定EX527與順鉑聯(lián)合處理對A549細胞活力的作用,
2.采用細胞計數(shù)的方法測定EX527與順鉑聯(lián)合處理對A549細胞增殖能力的影響。
3.采用3H-TDR摻入法測定EX527與順鉑聯(lián)合處理對A549細胞DNA合成能力的影響。
4.分別采用逆轉錄PCR和WesternBlotting來測定SIRT1在mRNA和蛋白
3、水平表達的變化,
5.采用SIRT1活性測定試劑盒測定EX527與順鉑聯(lián)合處理對A549細胞SIRT1活性的變化。
6.分別采用DAPI和AnnexinV-FITC染色法,在流式細胞儀上檢測EX527與順鉑聯(lián)合處理對A549細胞周期分布和細胞凋亡的作用,
7.采用DCFH-DA染色法測定A549細胞內(nèi)活性氧的變化,采用WesternBlotting來測定SIRT1靶分子乙?;捅磉_水平的改變。
結
4、果
1.順鉑和EX527單獨處理A549細胞都使細胞活力下降,并具有濃度依賴性和時間依賴性,EX527聯(lián)合順鉑處理A549細胞活力下降明顯低于順鉑處理組,具有統(tǒng)計學差異,EX527能增強順鉑對A549細胞的增殖和DNA合成抑制功能,EX527能夠增強順鉑誘導的G1期阻滯,誘導生成更多的SubG1期細胞,細胞凋亡更多。
2.順鉑單獨處理、EX527單獨處理和聯(lián)合處理組之間SIRT1mRNA水平?jīng)]有顯著的變化,順鉑處理可
5、以顯著升高SIRT1蛋白在A549細胞中的表達水平,而EX527處理則沒有明顯的作用,而且EX527不能抑制順鉑誘導的SIRT1蛋白表達,EX527能夠降低A549細胞內(nèi)源SIRT1的活性,而且顯著抑制由于蛋白水平升高導致的SIRT1的去乙酰化酶活性的升高。
3.順鉑可以升高A549細胞內(nèi)的活性氧成分,而且EX527可以進一步提升細胞內(nèi)的活性氧水平。EX527可以升高乙酰化p53的水平和Foxo3a及p21的表達水平。
6、 結論
EX527能夠明顯增強A549細胞對順鉑的敏感性,表現(xiàn)在細胞活力的降低、細胞增殖速度的減慢、DNA合成的抑制。EX527不是通過改變SIRT1的mRNA或蛋白表達水平來抑制其功能的,而是通過直接抑制SIRT1的去乙?;富钚?。EX527增強A549細胞對順鉑的敏感性可能的機制有:1.G1期細胞阻滯和細胞凋亡有關,2.與誘導更高水平的細胞內(nèi)活性氧水平有關。3.EX527可以提高p53的乙?;剑鰪妏53的促細胞周期
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