殼聚糖作為組織工程材料的初步研究.pdf

1、組織工程研究主要包括四個(gè)方面：種子細(xì)胞；組織工程支架材料；構(gòu)建組織器官的方法和技術(shù)以及組織工程的臨床應(yīng)用。其核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體，最大優(yōu)點(diǎn)是可形成具有生命力的活體組織，對(duì)病損組織進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達(dá)到永久性替代。理想的組織工程支架材料通常應(yīng)具備以下特點(diǎn)：良好的表面相容性與生物相容性，適度的生物降解速率，良好的結(jié)構(gòu)相容性，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度和可塑性。目前用作組織工程的生物材料主要有兩大類(lèi)：1.人工合成高

2、分子材料：聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乙烯醇、聚氨酯、聚酸酐；2.天然生物材料：殼聚糖、膠原、海藻酸鹽與天然珊瑚等。 殼聚糖作為自然界唯一存在的陽(yáng)性多糖，作為組織工程支架材料具有細(xì)胞黏附性強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞分化增殖，良好生物相容性和可生物降解；高表面積/體積比，一定的機(jī)械強(qiáng)度和可塑性。因此我們用干熱交聯(lián)NaCl致孔與冰凍干燥法分別制備了兩種殼聚糖支架樣品，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析兩種支架在孔隙率，吸水性能、機(jī)械力學(xué)性能、降

3、解率以及細(xì)胞組織相容性等方面的差異。相比冰凍干燥法，初步探討干熱交聯(lián)NaCl致孔作為新的簡(jiǎn)便可行的方法在制備殼聚糖三維立體支架中的可行性和安全性，為進(jìn)一步研究工作打下基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.干熱交聯(lián)NaCl致孔制備殼聚糖支架 按一定質(zhì)量比充分混合經(jīng)100目網(wǎng)篩碾壓篩過(guò)NaCl與純化殼聚糖粉，壓制成片，厚度為2mm左右，12MPa/cm2，1min。將殼聚糖-NaCl片置于105℃真空干燥箱內(nèi)干熱交聯(lián)24h；置雙

4、蒸水中48h，溶出NaCL。浸好的殼聚糖支架真空干燥待用。 2.冰凍干燥制備殼聚糖支架 配制2wt％的殼聚糖2％乙酸水凝膠，過(guò)濾，4℃冰箱過(guò)夜去除氣泡。澆注成膜，75℃冰箱24h，冷凍成型，冰凍干燥過(guò)夜。75％的酒精固定交聯(lián)，雙蒸水浸泡。洗過(guò)的殼聚糖膠體重新凍干過(guò)夜。 3.細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞吸附率 實(shí)驗(yàn)用支架(n=5)分為3組：CsN-1、CsN-2和凍干法。置于24孔培養(yǎng)板底，取0.8ml骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(

5、MSCs)懸液(5×104個(gè)/ml)放入孔中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中1h；吸附后，用1ml1MPBS輕輕的漂洗試樣；收集漂洗液體積=V，記數(shù)細(xì)胞濃度C，根據(jù)公式：吸附率=4×104-VC/4×104計(jì)算。 4.兩種殼聚糖支架的SD大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn) SD大鼠12只，雌雄不限，體重155～205g，隨機(jī)分為2組，每組6只。將滅菌支架材料(凍干法或CsN-2)埋入大鼠背部皮下組織。術(shù)后大鼠單籠喂養(yǎng)，每天觀察并記錄全身基本情

6、況與切口區(qū)變化。定期處死大鼠(2只/組)，切取支架與周?chē)?.5cm～1cm組織，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察。 結(jié)果： 1.熱交聯(lián)NaCl致孔法構(gòu)建殼聚糖三維立體支架(CsN-1～4)：隨著NaCl/Chitosan質(zhì)量比越大，所構(gòu)建多孔支架的孔徑越大，孔隙率越高(18～82％)，吸水性能越強(qiáng)(14～91％)，降解速率越快(殘存質(zhì)量比為75.12～88.54％)，彈性模量則下降(12.89～8.30N/mm2)。

7、 2.凍干法制備殼聚糖支架：具有高孔隙率(98.83±0.24％)和強(qiáng)吸水性(96.36±0.37％)，降解快(殘存質(zhì)量比為58.21％)，彈性模量(1.99±0.13N/mm2)與正常生物組織最接近。 3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明兩種方法制備的支架無(wú)細(xì)胞毒性，邊緣部位均可見(jiàn)MSCs黏附生長(zhǎng)?？梢?jiàn)有分布不均的MSCs延支架互通孔洞生長(zhǎng)分布支架內(nèi)部，生長(zhǎng)良好并分泌細(xì)胞外基質(zhì)填充支架間隙。 4.SD大鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn)表明兩種方

8、法制備的支架(CsN-2與凍干組)無(wú)組織毒性，刺激小，大鼠對(duì)兩種材料耐受性較好。HE染色組織切片顯示凍干法制備支架立體結(jié)構(gòu)易崩解，降解快，不能起到暫時(shí)錨定細(xì)胞與組織塑形作用；干熱交聯(lián)法制備支架立體結(jié)構(gòu)保持能力強(qiáng)，降解速度慢，與植入部位組織結(jié)合緊密，支架內(nèi)部可見(jiàn)大量的成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)分泌形成，膠原排列相對(duì)有序，可見(jiàn)新生血管。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新采用熱交聯(lián)，鹽致孔的方法成功構(gòu)建殼聚糖三維立體支架，其中以CsN-2組

9、支架綜合性能最優(yōu)秀。 2.凍干法制備的殼聚糖支架具有高孔隙率和強(qiáng)吸水性，伸展性能與正常生物組織最接近。 3.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明兩種方法制備的支架無(wú)細(xì)胞毒性，干熱交聯(lián)法制備支架比凍干法更適合MSCs黏附生長(zhǎng)增殖爬入。 4.SD大鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn)表明兩種方法制備的支架無(wú)組織毒性，刺激小。干熱交聯(lián)法制備支架立體結(jié)構(gòu)保持能力強(qiáng)，降解速度慢，起到良好的細(xì)胞引導(dǎo)與組織塑形作用。 5.綜合分析，干熱交聯(lián)法制備支架CsN