嗜尸性蠅類的分子標記種屬鑒別與法醫(yī)學應用研究.pdf

1、第一部分、線粒體DNA中COI基因序列在常見嗜尸性蠅類種屬鑒別中的應用
　　目的：利用線粒體DNA(mtDNA)細胞色素氧化酶輔酶Ⅰ(COI)中的498bp和841bp基因序列，對常見嗜尸性蠅類進行種屬鑒別，解決依據(jù)形態(tài)學方法難以鑒別現(xiàn)場樣本種屬的難題，為法醫(yī)現(xiàn)場檢案提供幫助。
　　方法：收集不同地區(qū)的2科4屬6個種的嗜尸性蠅類樣本，經(jīng)專業(yè)人員對樣本進行形態(tài)學檢驗，分別提取樣本mtDNA，利用COI基因序列中的兩對引物進行不

2、同序列PCR擴增，以瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，PCR膠回收試劑盒純化，ABI377測序儀測序，將所得序列以DNAMAN6.0分析軟件分別截取498bp和841bp長度的序列，分別輸入GenBank進行BLAST檢索同源相似性比對，以MEGA5.1軟件進行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析不同地區(qū)及不同種屬的樣本鑒別效果。
　　結(jié)果：5個地區(qū)6種嗜尸性蠅類30個樣本，mtDNA的COI基因序列Ⅰ(498bp) BLAST種屬同源性正確比對

3、28個，正確比對率達到93.33％，種內(nèi)進化分歧均數(shù)在0.1％～1.6％之間，種間進化分歧均數(shù)在2.2％～11.2％之間，除絲光綠蠅與銅綠蠅2個近緣種屬難以區(qū)分外，其余4個種屬通過系統(tǒng)發(fā)育樹可明確區(qū)分。3個地區(qū)6種嗜尸性蠅類36個樣本，mtDNA的COI基因序列Ⅱ(841bp) BLAST種屬同源性正確比對35個，正確比對率達到97.22％，種內(nèi)進化分歧均數(shù)在0.2％～1.5％之間，種間進化分歧均數(shù)在2.7％～10.6％之間，6個種屬通

4、過系統(tǒng)發(fā)育樹均可明確區(qū)分。
　　結(jié)論：COI基因序列同源性比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的種屬鑒別方法，是嗜尸性蠅類形態(tài)學種屬檢驗的重要補充手段，對嗜尸性蠅類樣本種屬的快速、準確鑒定有重要作用。
　　第二部分、不同食物成分對大頭金蠅生長發(fā)育的影響
　　目的：觀察不同臟器及不同脂肪含量的肌肉組織對大頭金蠅生長發(fā)育的影響，為昆蟲學相關(guān)研究及死后間隔時間(Post mortem interval，PMI)的法醫(yī)學推斷提供理論依據(jù)。

5、r>　　方法：取豬的腦、心臟、肝臟及腎臟制作4種臟器培養(yǎng)基，同時取肌肉和皮下脂肪組織，按照脂肪含量0％，10％，30％，50％和80％的質(zhì)量比重，分別制作5種混合食物培養(yǎng)基;在25℃恒溫條件下，以不同培養(yǎng)基飼養(yǎng)大頭金蠅初孵幼蟲，幼蟲孵化16h開始每12h取樣測量幼蟲體長和體重，化蛹后取樣測蛹長及蛹重，每次取樣10只，同時觀察并記錄不同階段的樣本數(shù)量，計算發(fā)育歷期，羽化完畢后計算各組幼蟲及蛹的死亡率和成蟲性別比率，實驗重復5次統(tǒng)計各組之間

6、的差異。
　　結(jié)果：不同臟器組織對大頭金蠅幼蟲、蛹及成蟲的體長、體重產(chǎn)生明顯影響（P＜0.01），與其他3組比較取食肝組織的幼蟲生長緩慢（P＜0.01），達到最大體長和體重的時間延遲36 h，其2齡、3齡幼蟲期及總發(fā)育歷期明顯大于其他3組(P＜0.01);食物脂肪含量對大頭金蠅幼蟲、蛹及成蟲的體長、體重產(chǎn)生明顯影響（P＜0.01），高脂肪組織食物早期可促進幼蟲生長，孵化40 h后則抑制其生長并使發(fā)育歷期縮短（P＜0.01），幼蟲及

7、蛹的死亡率增高(P＜0.01);不同組織源食物對成蟲的性別比率無明顯影響（P＞0.03）。
　　結(jié)論：食物成分的不同會對大頭金蠅個體大小、生長發(fā)育歷期及死亡率可產(chǎn)生明顯影響，在昆蟲學相關(guān)研究及法醫(yī)學檢案的PMI推斷時應引起足夠重視。
　　第三部分、固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜法測定大頭金蠅樣本內(nèi)的氯氮平
　　目的：建立嗜尸性蠅類樣本內(nèi)氯氮平（clozapine，CLP）的有效定量檢測方法，為此類藥物中毒死亡案件的法醫(yī)學檢驗分

8、析提供幫助。
　　方法：采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)的方法，以100μm聚二甲基硅氧烷萃取頭萃取，洛沙平為內(nèi)標，氣相色譜質(zhì)譜選擇離子方式檢測，建立標準曲線，定量檢測大頭金蠅幼蟲及蛹樣本內(nèi)的CLP;分析不同發(fā)育時期，取食含有不同濃度CLP的肌肉組織的樣本內(nèi)CLP含量，比較食物與樣本體內(nèi)CLP濃度間的關(guān)系。
　　結(jié)果：實驗建立的SPME-GC-MS法能準確定量檢測昆蟲樣本內(nèi)的氯氮平，CLP的檢出限為