人FcγRIIB慢病毒表達載體的制備及其功能初步研究.pdf

1、目的:構建人FcγRⅡB慢病毒誘導表達載體，檢測人FcγRⅡB慢病毒誘導表達載體在HT-1080細胞表面可調控的穩(wěn)定表達，并初步研究其對B細胞功能的影響。
　　方法:以人mRNA為模版逆轉錄獲得FcγRⅡB基因片段，并將其克隆入慢病毒表達質粒TRE，構建TRE-FcγRⅡB慢病毒表達重組質粒。將慢病毒表達重組質粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒調節(jié)質粒Tet分別與慢病毒包裝質粒共轉染HEK293T細胞，分別包裝表達病毒和調節(jié)病毒，分別

2、測定表達病毒和調節(jié)病毒感染滴度。表達病毒和調節(jié)病毒共感染HT-1080細胞，經(jīng)梯度濃度強力霉素（Dox）誘導，免疫熒光染色檢測HT-1080細胞表達FcγRⅡB，實時定量PCR檢測FcγRⅡBmRNA表達，Western blot法檢測FcγRⅡB蛋白表達。表達病毒和調節(jié)病毒共感染Ramos細胞，經(jīng)1000 ng/mL強力霉素（Dox）誘導，免疫熒光檢測FcγRⅡB的表達和FcγRⅡB與SLE患者血清免疫復合物（IC）中IgGFc端的結

3、合能力。LPS刺激感染后的Ramos細胞，ELISA法檢測過表達FcγRⅡB對Ramos細胞分泌IgM抗體的影響。
　　結果:重組質粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，測序結果顯示插入片段堿基序列與GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100％。表達病毒滴度達106TU/mL，調節(jié)病毒滴度達105TU/mL，感染性良好。HT-1080細胞被病毒感染后經(jīng)Dox誘導表達FcγRⅡB，免疫熒光染色結果顯示FcγRⅡB能夠在HT-1080細