雷帕霉素靶蛋白通路激活在脂代謝紊亂介導的靶器官損傷中的作用研究.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)所致心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)常見的并發(fā)癥和主要死亡原因。與AS發(fā)生相關的主要危險因素包括脂代謝異常和微炎癥反應等。研究發(fā)現，慢性炎癥在加速脂代謝紊亂介導的AS等靶器官損傷中扮演重要作用。炎癥能夠通過介導低密度脂蛋白受體(low-densitylipoprotein

2、receptor, LDLr)表達失調，導致細胞內膽固醇攝入增加，破壞細胞內膽固醇穩(wěn)態(tài)調節(jié)，但該作用可被雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)抑制劑-雷帕霉素所抑制，提示mTOR信號激活可能參與了炎癥誘導的LDLr表達失調。然而，mTOR信號如何被激活、活化的mTOR信號是否參與LDLr的表達失調以及具體的作用機制如何，目前尚不十分清楚。因此，本研究擬在此基礎上，通過臨床研究，體內、體外

3、研究，探討mTOR通路激活在炎癥及脂代謝紊亂介導的靶器官損傷中的作用及其可能的作用機制。
　　方法:研究內容包括血管損傷和肝臟損傷研究，血管損傷研究又包括臨床研究和基礎研究。血管損傷臨床研究，觀察炎癥誘導LDLr表達失調在ESRD患者橈動脈泡沫細胞(foam cell，FC)形成中的作用，并初步探討mTOR通路激活與LDLr表達失調是否具有相關性。30例ESRD患者被納入研究，根據血清C反應蛋白水平分為對照組(n=16)和炎癥組(

4、n=14)，取材動-靜脈內瘺手術時部分切除的橈動脈組織。搜集兩組患者的基礎臨床資料，采用HE及油紅O染色觀察橈動脈內FC形成情況，免疫化學染色檢測mTOR、LDLr及其基因轉錄調節(jié)相關因子的表達。血管損傷基礎研究，觀察mTORC1激活在炎癥介導AS發(fā)生中的作用，探索mTORC1在LDLr負反饋調節(jié)失調中的作用及可能作用機制。體內研究，將高脂喂養(yǎng)的8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout, ApoE

5、 KO)小鼠隨機分為對照組，炎癥組，雷帕霉素組，炎癥+雷帕霉素組。8周后處死小鼠，收集血漿標本及主動脈組織;體外研究，選擇脂多糖刺激大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)，同時應用雷帕霉素或siRNA方法抑制mTOR活性。ApoE KO小鼠血清用于檢測脂質譜及炎癥因子水平，HE及油紅O染色觀察胞內脂質積聚情況，流式細胞儀測定細胞周期，免疫組化、免疫熒光染色、Real-time PCR及We

6、stern Blot法檢測組織及細胞內LDLr負反饋通路調節(jié)因子、mTORC1信號通路相關蛋白以及細胞周期蛋白的表達情況。肝臟損傷研究，觀察mTORC1激活在炎癥介導肝臟損傷發(fā)生中的作用，探討mTORC1對LDLr轉錄水平和轉錄后水平表達失調的影響。體內研究所用的動物模型，與第二部分相同，觀察對象為肝臟組織。體外研究，應用白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)聯合雷帕霉素或mTOR siRNA方法，干預人肝細胞株(Hum

7、an hepatoblastoma cell line，HepG2 cell)，并通過病理染色及化學酶促-比色法觀察肝臟細胞內脂質積聚情況，免疫組化、免疫熒光染色、Real-time PCR及Western Blot法檢測組織及細胞內LDLr轉錄及轉錄后水平調節(jié)因子以及mTOR信號通路相關因子表達情況。
　　結果:1）炎癥組與對照組ESRD患者在臨床基本生化等指標均無明顯差異;炎癥組患者橈動脈腫瘤壞死因子(tumor necros

8、is factor, TNF-α)及單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotacticprotein1，MCP-1)表達增加，并伴隨大量脂質沉積;對介導細胞內膽固醇攝取的LDLr進行研究，發(fā)現炎癥組患者橈動脈LDLr表達及固醇調節(jié)元件結合蛋白-2（sterol regulatory dementbinding protein-2，SREBP-2）裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein

9、，SCAP）由內質網向高爾基體的轉位顯著增加。進一步分析顯示，炎癥組LDLr表達增加與mTOR表達上調呈顯著正相關(r=0.733，p＜0.05);且炎癥組mTOR與SREBP-2共表達明顯高于對照組。2）通過皮下注射酪蛋白，成功構建微炎癥動物模型，且炎癥能夠誘導脂質重分布，由血液循環(huán)向主動脈組織內轉運，而雷帕霉素組小鼠主動脈形態(tài)完整，且僅少量脂質沉積;這一效應與炎癥誘導mTOR激活，導致LDLr負反饋調節(jié)失衡密切相關，炎癥增加LDLr

10、、SREBP-2、SCAP表達，并促進SCAP由內質網向高爾基體共轉位;然而，應用雷帕霉素或mTOR siRNA干預細胞后，胞內mTORC1活性被抑制，且LDLr及其轉錄調節(jié)因子SREBP-2、SCAP表達亦隨之減少。進一步研究證實，炎癥狀態(tài)下mTORC1能夠磷酸化激活細胞周期蛋白-視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma tumour suppressor protein, Rb)，并增加細胞內活性SREBP-2在細胞周期S期

11、的表達，進而啟動LDLr基因轉錄。3）應用微炎癥模型觀察對肝損傷的影響，結果證實，炎癥能夠誘導脂質從血液循環(huán)向肝臟組織內轉運，而雷帕霉素能夠明顯減少肝細胞內脂質沉積;炎癥顯著增加肝臟細胞LDLr表達，其轉錄水平調控元件SREBP-2及SCAP表達亦顯著增加，而轉錄后水平調節(jié)因子前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertasesubtilisin kexin type9，PCSK9)表達則減少;進一步研究發(fā)現，炎癥誘導

12、的LDLr表達失調與mTORC1通路激活密切相關，炎癥能夠誘導mTORC1通路激活，而雷帕霉素或mTOR siRNA干預后，胞內mTORC1活性明顯降低，且LDLr、SREBP-2及SCAP表達亦隨之減少，而PCSK9表達增多。
　　結論:
　　1、微炎癥狀態(tài)下，ESRD患者AS進展加速，其機制與炎癥誘導mTOR通路激活，破壞LDLr負反饋調節(jié)，導致細胞內膽固醇攝入增加，促進FC形成有關。
　　2、體內、外研究發(fā)現，炎

13、癥狀態(tài)下mTORC1磷酸化激活細胞周期蛋白Rb，可能通過大量增加細胞內活性SREBP-2在細胞周期S期的表達，啟動LDLr的基因轉錄，從而破壞LDLr負反饋調節(jié)，導致細胞內膽固醇沉積增多，進而演變?yōu)镕C，加速AS進展。
　　3、肝臟作為膽固醇代謝的重要器官，mTORC1通路激活參與炎癥介導的LDLr轉錄和轉錄后水平表達失調，導致肝細胞內LDLr表達增強，細胞對膽固醇攝取增多，最終促進肝臟損傷。
　　4、本研究闡明了炎癥介導的