內皮祖細胞移植延緩進展性局灶節(jié)段性腎小球硬化的實驗研究.pdf

1、本研究擬采用文獻報道的改良阿霉素腎病誘導的FSGS模型，即單側腎切除后分次注射阿霉素，如果不給予其他干預措施，動物將在腎切除和注射阿霉素后12-16周發(fā)展為FSGS。在本實驗中阿霉素第二次注射后1周，即FSGS的進展過程中，將體外培養(yǎng)的EPCs移植，依賴EPCs的“歸巢”特性使EPCs向受損的大鼠腎臟歸巢，觀察其對FSGS的進展是否有延緩作用。由于VEGF的半衰期僅30-40分鐘，直接補充VEGF的作用時間非常短暫，而且全身使用有諸多問

2、題包括增加腫瘤風險、濃度不能維持以及價格昂貴等，因而將VEGF165重組腺病毒在體外構建并轉染培養(yǎng)獲得的EPCs再移植給阿霉素誘導的進展期FSGS大鼠，EPCs在體內修復足細胞等細胞損傷的同時，持續(xù)合成分泌VEGF165，觀察轉染VEGF165的EPCs對FSGS進展是否比單用EPCs有更好的延緩作用，探討‘EPCs移植和VEGFl65轉染：EPCs移植在’FSGS進展中的作用和可能機制，為臨床采用EPCs移植和VEGF轉染EPCs移植

3、治療FSGS的設想提供實驗依據。 主要實驗方法及結果： 1.大鼠骨髓來源的內皮祖細胞的分離、體外誘導培養(yǎng)及鑒定 采用密度梯度離心法從雄性SD大鼠骨髓中得到單個核細胞，在特定的條件下進行分離純化，通過貼壁法培養(yǎng)、體外擴增獲取貼壁細胞，采用流式細胞表型檢測、免疫細胞化學及免疫雙熒光等方法進行鑒定。結果證實，通過此方法獲得的細胞即是EPCs，為EPCs移植作好了準備。采用雄性大鼠EPCs的目的是將雄性大鼠特有的Y染色體

4、作為外源性EPCs的標記。 2.腺病毒介導的VEGF165基因轉染內皮祖細胞的實驗研究 用限制性內切酶XbaⅠ+HindⅢ從質粒載體中切出VEGF165基因片段，與KpnⅠ +HindⅢ雙酶切的pAdTrack-CMV形成轉移質粒pAdTrack-CMV-VEGF165，PmeⅠ酶切線性化后與腺病毒基因組質粒pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183，并在293細胞中包裝成Ad-VEGF165，PCR和West

5、ernBlot法鑒定目的蛋白表達。貼壁法體外培養(yǎng)獲得大鼠骨髓來源的EPCs(同前)，Ad-VEGF165體外轉染EPCs，檢測轉染后目的基因蛋白表達情況。 結果顯示：利用CsC12法由pAdqTrack-VEGF165和pAdEasy-1共轉化BJ5183感受態(tài)菌，可獲得陽性重組體細菌克隆。PCR和WesternBlot以及基因測序分析進行鑒定，表明重組腺病毒已含有目的基因，并能夠高效表達目的蛋白，序列正確；病毒滴度為1.4×1

6、010pfu/ml。Ad-VEGF165基因轉染培養(yǎng)第6d的EPCs后24h開始培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達顯著增加。證實體外構建VEGF165重組腺病毒成功并且可以成功轉染EPCs，EPCs合成和分泌VEGF顯著增加，為VEGF165轉染EPCs移植到動物的在體實驗提供了基礎。 3.內皮祖細胞移植或VEGF165基因轉染內皮祖細胞移植對進展性FSGS的進展的影響 雌性SD大鼠隨機分為正常對照組(對照組)、阿霉素腎病組(腎

7、病組)、EPC移植組(EPC組)和VEGF轉染EPCs后移植組(VEGF組)。腎病組、EPC組和VEGF組行單腎切除，術后1w和2w分別尾靜脈注射阿霉素制作阿霉素誘導的FSGS，對照組假手術并在相同時間點注射生理鹽水。于第二次注射阿霉素后1w，5Gy的X線全身照射后，EPC組尾靜脈注射移植1×106的EPCs，VEGF組尾靜脈注射移植1×106轉染了VEGF165重組腺病毒的EPCs，對照組和腎病組僅行同等劑量的X線照射和生理鹽水注射。

8、在切腎前(0w)和切腎后的第4(即EPCs移植后1w)、8、12、16w測大鼠體重、尿蛋白，處死大鼠取血測血清肌酐(SCr)、白蛋白(ALB)，原位雜交法觀察腎組織中Y染色體陽性細胞摻入情況，以證實雄性供鼠來源的EPCs到達并整合入雌性受鼠的腎組織中；觀察腎臟超微結構和組織學變化，圖像分析計算腎小球硬化指數(shù)、腎小球毛細血管袢管腔開放程度及毛細血管袢截面積，同時免疫組化和WesternBlot檢測腎組織中VEGF的表達，并檢測與細胞外基質

9、(Extracellularmatrix，ECM)代謝關系非常密切的轉化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1)和多種腎臟固有細胞向肌成纖維細胞表型轉化的標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)在腎組織中的表達，作為各組腎組織慢性化轉化程度的指標。 結果顯示：(1)原位雜交的結果證實雄性大鼠來源的EPCs到達并整合到雌性阿霉素腎病大鼠的腎臟組織中，

10、而且這種整合從移植后1w直到實驗終點，但有逐漸減弱趨勢。整合的部位位于腎小球內和腎小管上皮細胞。(2)腎病組大鼠的一般情況最差，次第為EPC組、VEGF組，對照組一般情況較好，一般情況包括大鼠精神、進食和體重。(3)實驗室檢查：EPC組和VEGF組從第4w開始尿蛋白即顯著低于腎病組，在第8w和第12wVEGF組尿蛋白顯著低于EPC組(p＜0.05)；SCr測定顯示，EPC組從第8w開始SCr顯著低于腎病組，VEGF組SCr從第4w開始顯

11、著低于腎病組，至第16w時有所增高，但顯著低于腎病組和EPC組；ALB結果顯示，EPC組的ALB從第4w開始下降，各時間點均顯著低于對照組，但第12、16w時顯著高于腎病組；VEGF組的結果與EPC組的結果相似，但在12w和16w，VEGF組ALB顯著高于EPC組(p＜0.05)。這些結果提示EPCs移植參與了EPC組和VEGF組尿蛋白下降、腎功能異常出現(xiàn)時間的延后以及血清ALB提高。(4)腎臟組織學和圖像分析的結果顯示，第16w時EP

12、C組和VEGF組腎小球毛細血管管腔開放程度顯著高于腎病組，且VEGF組顯著高于EPC組，VEGF組的毛細血管腔開放最好；毛細血管袢截面積的結果與。腎小球毛細血管腔開放程度的結果相似，系膜基質相對含量也顯示EPC組和VEGF組較腎病組顯著降低，VEGF組又顯著低于EPC組；腎病組腎小球硬化指數(shù)顯著高于EPC組和VEGF組，而VEGF組的腎小球硬化指數(shù)最低。(5)透射電鏡觀察腎組織超微結構的結果顯示：EPC組和VEGF組腎小球足細胞損傷修復

13、和腎小管上皮細胞損傷的減輕均早于腎病組，而VEGF組修復出現(xiàn)的時間更早。(6)免疫組化染色和WesternBlot分析顯示：EPC組和VEGF組的腎組織VEGF表達較對照組和腎病組明顯增強，直到實驗終點；VEGF組腎組織的VEGF表達較EPC組更強，VEGF蛋白表達也證實此結果；腎病組、EPC組和VEGF組腎組織TGF-β1、α-SMA的表達均隨實驗時間的延長逐漸增強，但EPC組和VEGF組較同時間點的腎病組明顯減弱，而VEGF組的表達

14、最弱；其蛋白表達也證實此結果。 結論： 1.采用密度梯度離心法收集骨髓中的單個核細胞，在特定的誘導條件下通過貼壁培養(yǎng)可以獲取足夠數(shù)量的EPCs，在短時間內可在體外擴增，并最終在體外分化為有功能的具有內皮細胞特異性標志物的成熟血管內皮細胞。 2.采用DNA重組技術成功構建了Ad-VEGF165重組腺病毒，且Ad-VEGF165能高效、穩(wěn)定地表達VEGF165目的基因且具有良好的安全性；構建的Ad-VEGF165能夠