重組人血白蛋白與小分子藥物結合功能研究.pdf

1、目的：人血白蛋白(簡稱HSA)是由585個氨基酸組成的非糖化單鏈結構的心型分子，分子量約66500d，主要由人體肝臟產生，在血漿中含量為42±3.5g/L。人血白蛋白在臨床上主要用于治療嚴重的低蛋白血癥和失血性休克，在體內可作為小分子藥物的載體能與藥物可逆性結合，從而影響藥物的代謝、毒性、儲存和運輸。目前臨床上所使用的HSA是通過低溫乙醇法或層析法從人靜脈血漿或胎盤血中提取的血漿蛋白制劑，該方法一方面因血液受到潛在HIV病毒、肝炎病毒污

2、染而存在潛在的威脅，另一方面如果血源供應不足，HSA也會發(fā)生周期性的貨源短缺。因此，研究開發(fā)更加安全并能保證供給的重組人血白蛋白(簡稱rHSA)引起眾多公司的興趣。據目前國內外對人血白蛋白與藥物結合功能的研究，人血白蛋白有兩個主要的藥物結合位點，選擇華法令(結合位點Ⅰ)和地西泮(結合位點Ⅱ)作為人血白蛋白兩個主要結合位點標志性結合藥物對重組人血白蛋白和天然人血白蛋白(簡稱pHSA)與小分子藥物的結合功能進行了比較，研究天然人血白蛋白和重

3、組人血白蛋白在與小分子藥物結合功能方面有無差別，并且用中藥有效成分鹽酸小檗堿再加以驗證。 方法：地西泮在366nm下有特征吸收，且易溶于甲醇等有機溶劑，難溶于水：而人血白蛋白在366nm下無吸收，但不溶于有機溶劑。經過反復調整有機溶劑與水的混合比例，發(fā)現在10％甲醇溶液中地西泮和人血白蛋白都能很好地溶解，并且沒有沉淀生成。當地西泮與人血白蛋白結合后形成人血白蛋白-地西泮復合物后，在366nm下地西泮的特征吸收消失。基于這個原理，

4、取地西泮用10％甲醇溶解后，在366nm下測定不同濃度地西泮的光吸收，可以得到地西泮濃度-吸收標準曲線。加入定量合適濃度的人血自蛋白，可以在366nm下通過測定特定濃度下的地西泮與人血白蛋白結合前后吸收值的變化計算得到二者的結合常數；在人血白蛋白體外功能研究中，華法令作為藥物結合位點I的特征藥物，可以結合在人血自蛋白的疏水位點上。人血白蛋白分子量為66500d，華法令分子量為338.34d，游離華法令與人血白蛋白-華法令復合物和游離人血

5、白蛋白分子量相差非常大?；谶@個原理可以通過Sephadex G-25凝膠過濾層析對游離華法令與人血白蛋白-華法令復合物和游離人血白蛋白實現很好的分離。Sephadex G-25 HPLC緩沖液為：67mmol/l PH7.4的磷酸緩沖液A；以緩沖液A配制86.3umol/l的華法令溶液B；以緩沖液A和脫脂后的pHSA和rHSA配制成31.5mg/ml溶液C；在308nm下對華法令和華法令與人血白蛋白混合的樣品分別進行Sephadex

6、G-25HPLC檢測，混合比例為250ulA+1500ulB+750ulC，并對HPLC出峰結果分別積分。因此在華法令與人血白蛋白結合后用SephadexG-25 HPLC柱進行分離后，對游離華法令和二者結合產物分別積分得到華法令與人血白蛋白的結合率。 人血白蛋白中的214乙酰色氨酸具有熒光性質，根據熒光靜態(tài)淬滅理論，用鹽酸小檗堿(簡稱BH)為熒光猝滅劑，根據熒光測定值變化，可以計算藥物結合常數。取HSA溶液作為熒光激發(fā)光譜和發(fā)

7、射光譜掃描，當激發(fā)波長為299nm時，發(fā)射光譜波長在353nm時熒光強度最大，并且BH在此條件下無熒光峰干擾。HSA濃度為4*10-5mol/L，在保證HSA終濃度不變的情況下，加入不同濃度的BH，在激發(fā)波長299nm和發(fā)射波長353nm條件下測定對HSA的熒光猝滅情況，從而得出人血白蛋白和鹽酸小檗堿的解離常數。 結果：重組人血白蛋白與地西泮的結合常數為14.68molDiazepam/mol rHSA，而天然人血白蛋白與地西泮

8、結合常數為12.82mol Diazepam/mol pHSA；重組人血白蛋白中華法令的結合率為8.69％，而天然人血白蛋白中華法令的結合率為6.73％；重組人血白蛋白與鹽酸小檗堿的結合常數為2.44×103l/mol，而天然人血白蛋白與鹽酸小檗堿的結合常數為2.77×103l/mol。 結論：重組人血白蛋白與天然人血白蛋白在與地西泮和華法令的結合功能上基本一致，鹽酸小檗堿的研究進一步證明了這一點。因此可以認為重組人血白蛋白和天