三角帆蚌珍珠形成相關基因的克隆與表達分析.pdf

1、三角帆蚌（Hypriosis cumingii）是我國主要的淡水育珠蚌，其每年的淡水珍珠產量占世界的95％以上。研究三角帆蚌珍珠形成相關基因的功能對珍珠形成機制研究具有重要意義。通過三角帆蚌轉錄組測序得到的信息，篩選出2個perlucin基因和BMP7基因部分基因序列，采用RACE技術得到3個基因cDNA全長序列。為研究這3個基因的功能，首先對7個管家基因進行穩(wěn)定性分析，最終得到3個合適的內參基因。利用熒光定量技術對3個基因在不同組織中

2、、貝殼修復過程中及早期珍珠形成過程中表達量進行分析，利用原位雜交技術對基因在外套膜的表達進行定位分析。嘗試將 Hc-perlucin1蛋白在原核系統(tǒng)中進行表達。主要的研究結果如下：
　?。?）三角帆蚌內參基因的篩選
　　對β-actin、β-tubulin、elongation factor1 alpha（EF1α）、GAPDH、ubiquitin、ribosomal protein L18（Rpl18）以及cyclophi

3、lin共7個管家基因，采用BestKeeper，geNorm和NormFinder軟件分析了其在不同組織間、不同季節(jié)外套膜、貝殼修復過程和早期珍珠形成過程中的表達穩(wěn)定性。結果表明，Ubi、RPL18和EF1α這3個管家基因在本論文所設置的實驗條件下的表達相對穩(wěn)定，是作為研究三角帆蚌貝殼和珍珠形成中基因表達分析的合適內參基因。
　?。?）2個perlucin基因的克隆及表達分析
　　克隆得到2個C型凝聚素基因Hc-perluc

4、in1和Hc-perlucin2，兩基因cDNA全長分別是1460 bp和1973 bp，包括18 bp和438 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR），908 bp和972 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。分別可編碼161個和183個氨基酸，Hc-perlucin1基因有信號肽，而Hc-perlucin2基因無信號肽。兩個基因都含有6個保守的半胱氨酸和1個CRD結構域。Hc-perlucin1和Hc-perlucin2基因在C端分別是―QPS

5、‖和―EPN‖，這說明它們分別與半乳糖和甘露糖特異性結合。通過熒光定量分析，兩個基因在三角帆蚌9個組織中均有表達，在鰓、閉殼肌和外套膜表達量都比較高。除此之外，Hc-perlucin1在血細胞中的表達量也比較高，Hc-perlucin2基因在腸道中表達量較高。在貝殼修復過程中 Hc-perlucin1基因在珍珠層形成過程中表達量有明顯的上升，而 Hc-perlucin2基因表達量則有所下降。在早期珍珠形成過程中，兩個基因表達量都有明顯的

6、上升。原位雜交結果也顯示兩個基因在外套膜中的表達位置一致，都在外套膜外側上皮細胞中表達，該區(qū)域的細胞主要是參與珍珠層的形成。因此，三角帆蚌perlucin基因可能參與了珍珠層的形成。
　?。?）Hc-BMP7基因的克隆與表達分析
　　克隆得到Hc-BMP7基因cDNA全長為2080 bp，包括377 bp的5’端非翻譯區(qū)（UTR）和401 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。開放閱讀框的長度是1287 bp，可編碼428個氨基酸

7、，前26個氨基酸是信號肽。Hc-BMP7含有一個TGF-β家族指紋，TGF-beta propeptide和TGFB兩個結構域。Hc-BMP7在9個組織中均有表達，其中以性腺、鰓、腎臟和外套膜的表達量較高。在貝殼修復過程和早期珍珠形成過程中，該基因在外套膜和珍珠囊中的表達量均沒有上調。原位雜交結果顯示該基因在外套膜外側上皮細胞和外套膜緣膜外褶上表達。
　　（4）Hc-perlucin1蛋白的原核表達
　　通過 PCR擴增得到

8、 Hc-perlucin1基因整個開放閱讀框，與線性表達載體pET-28a連接組成重組載體，轉化到大腸桿菌BL21（DE3），經IPTG誘導表達重組融合蛋白 pET-28a-Hc-perlucin1。通過不同梯度的培養(yǎng)溫度、IPTG濃度以及誘導時間的實驗組合，實驗結果表示重組融合蛋白在最佳表達條件分別為：37℃、0.1 mmol/L IPTG、6 h。pET-28a-Hc-perlucin1重組融合蛋白主要以包涵體形式存在。通過SDS-