沙眼衣原體抗菌素耐藥及治療失敗的評(píng)估.pdf

1、目的：探討對(duì)泌尿生殖道沙眼衣原體臨床株進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)的意義；檢測(cè)本地區(qū)近年來(lái)泌尿生殖道沙眼衣原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗菌素的體外藥物敏感性；篩查耐藥株，并從基因水平上探討其耐藥機(jī)制；評(píng)價(jià)藥敏結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性，評(píng)估抗菌素耐藥與臨床治療失敗。
　　 方法：培養(yǎng)McCoy細(xì)胞至孔板中，置于37℃、5％CO2溫箱中孵育，18～24h后生長(zhǎng)至致密單層后，接種沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株，培養(yǎng)48～72h后，用盧戈氏碘液染色

2、鑒定培養(yǎng)結(jié)果，凡是培養(yǎng)陰性的標(biāo)本繼續(xù)傳代培養(yǎng)至五代。為評(píng)估多次傳代后培養(yǎng)法的敏感性，選用沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒基因片段為引物，PCR擴(kuò)增檢測(cè)沙眼衣原體；42株陽(yáng)性標(biāo)本傳代培養(yǎng)至感染率達(dá)90％以上，收集標(biāo)本進(jìn)行9種常用抗菌素的藥敏試驗(yàn)。核酸擴(kuò)增臨床分離株的omp1基因并用AluⅠ、MspⅠ雙酶切進(jìn)行基因分型。PCR方法擴(kuò)增檢測(cè)四環(huán)素耐藥質(zhì)粒tetM基因；同時(shí)用RT-PCR，PCR方法分別擴(kuò)增與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)的23S核蛋白體RNA基因、核

3、糖體蛋白基因L4，通過(guò)產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)基因突變；限制性片段分析（RFLP）檢測(cè)gyrA喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone-Resistance Determining Region，QRDR）常見(jiàn)的基因點(diǎn)突變。統(tǒng)計(jì)方法：試驗(yàn)結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析，確定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算卡方值、相關(guān)系數(shù)，確定P值，P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：299例樣本中細(xì)胞培養(yǎng)法共檢測(cè)到10

4、4株陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為34.78％。初次培養(yǎng)（原代）陽(yáng)性率5.69％，傳代一次后（二代）陽(yáng)性率為20.07％，傳代兩次后（三代）陽(yáng)性率為33.44％，傳代三次后（四代）陽(yáng)性率為34.78％，傳代四次后（五代）陽(yáng)性率仍為34.78％。前三代隨著傳代，陽(yáng)性例數(shù)及陽(yáng)性率明顯增加，而四代、五代基本上處于穩(wěn)定趨勢(shì)。PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果除了24例培養(yǎng)法檢測(cè)陰性而PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本外，余與細(xì)胞培養(yǎng)法完全一致。臨床標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果與臨床療效之間

5、存在關(guān)聯(lián)性（x2=8.242，P=0.004<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床治療成功的標(biāo)本更易于細(xì)胞培養(yǎng)，治療失敗的標(biāo)本不易于細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)，隨著多次傳代培養(yǎng)，陽(yáng)性率明顯增加。藥敏MIC（單位均為mg/L）結(jié)果分別為紅霉素：0.5～2，克拉霉素：0.008～0.032，阿奇霉素：0.125～0.5，四環(huán)素：0.157～0.625，多西環(huán)素：0.063～0.125，米諾環(huán)素：0.032～0.128，左氧氟沙星：0.5～1，莫西沙星：0.

6、06～0.12，司帕沙星：0.064～0.128，其中發(fā)現(xiàn)2株紅霉素耐藥株（MIC值：2mg/L），其23s rRNA基因有C2452A、T2611C的突變（大腸桿菌序列編號(hào)），紅霉素耐藥株及敏感株L4基因均發(fā)現(xiàn)脯氨酸113（CCG）→亮氨酸（CTG）、脯氨酸156（CCC）→丙氨酸（GCC）兩個(gè)位點(diǎn)的突變（GenBank NC000117.1），25株臨床分離株中檢測(cè)到tetM基因，未發(fā)現(xiàn)gyrA-QRDR-基因中Ser83→Ile點(diǎn)

7、突變。將42株臨床分離株進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株為D型，余均為E型。
　　 結(jié)論：傳代培養(yǎng)可以明顯提高臨床株沙眼衣原體的檢出率，盲傳一次的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)有一定的漏診率，臨床株應(yīng)傳代培養(yǎng)至三代，其培養(yǎng)的成功將為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展該病原體的致病機(jī)理、免疫機(jī)制、體外藥物敏感性檢測(cè)、耐藥機(jī)制和保護(hù)性疫苗等方面的研究奠定基礎(chǔ)。隨著時(shí)間的推移，抗菌素的敏感性呈不同程度的下降，克拉霉素體外抗沙眼衣原體活性最強(qiáng)。米諾環(huán)素，司帕沙星、莫西沙星等均有較強(qiáng)的抗沙

8、眼衣原體感染活性，但其MIC值較以往文獻(xiàn)報(bào)道增高。C2452A、T2611C的突變導(dǎo)致紅霉素低水平耐藥，L4基因的點(diǎn)突變可能與紅霉素耐藥無(wú)關(guān)，tetM基因陽(yáng)性率（59.2％）較高，表明體內(nèi)對(duì)四環(huán)素敏感性普遍降低。喹諾酮類實(shí)驗(yàn)室突變株可能在臨床株中并不常見(jiàn)。沙眼衣原體對(duì)抗菌素的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。E型為沙眼衣原體的優(yōu)勢(shì)基因型。以細(xì)胞培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效之間存在差異。臨床治療失敗影響培養(yǎng)結(jié)果，沙眼衣原體抗菌素耐藥可引起臨