補腎活血法促進TGF-β2基因修飾的ADSCs向軟骨細胞分化的作用和機制的實驗研究.pdf

1、目的:研究脂肪源性成體干細胞(ADSCs)體外增殖特性、表型特征及多向分化能力，探索補腎活血中藥干預對組織工程軟骨構建的作用及其機制。
　　方法:取SD大鼠雙側腹股溝部的脂肪墊，分離培養(yǎng)ADSCs，以流式細胞儀檢測原代ADSCs和篩選標志物表達。在二維培養(yǎng)的方式下將大鼠ADSCs進行成脂、成骨、成軟骨、成神經元誘導，觀察其成脂、成骨、成軟骨、成神經元能力并予以鑒定。構建攜帶hTGF beta2基因的5型復制缺陷型病毒，基因增強合并

2、補腎活血中藥含藥血清干預體外培養(yǎng)的ADSCs向軟骨細胞分化:分為四組:空白對照足組、單純中藥組、基因轉染組和中藥+基因轉染組。通過形態(tài)學觀察、行HE、甲苯胺藍染色、PCR、WB及Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色鑒定軟骨細胞表型。
　　結果:從SD大鼠脂肪組織可以獲得純度較高的ADSCs，而且具有良好的增殖能力，能夠進行傳代培養(yǎng)并能保持其特性。流式細胞儀檢測顯示CD45、CD106呈陰性表達，CD29、CD44、CD90呈陽性表達。在

3、二維培養(yǎng)環(huán)境中，大鼠ADSCs經過成脂、成骨、成軟骨、成神經元誘導和組織學、免疫組化鑒定，均成功獲得目的細胞。體外實驗中基因轉染組和中藥+基因轉染組的ADSCs在誘導14天后細胞爬片經甲苯胺蘭染色和Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色呈陽性，經aggrecan細胞免疫熒光檢測見細胞的胞漿、胞膜均有綠色熒光表達，而空白對照組和單純中藥組則僅維持貼壁生長，其標本在14天后經甲苯胺蘭染色、Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色和aggrecan細胞免疫熒光檢測

4、，其結果均為陰性;同時RT-PCR和Westem-blot檢測發(fā)現(xiàn)2周時中藥+基因轉染組較基因轉染組標本中Col2al、hTGFbeta-2和aggrecan的mRNA和蛋白的表達水平上調(P＜0.05)，空白對照組和單純中藥組中無表達。
　　結論:
　　1.自SD大鼠腹股溝取材可以獲得純度較高的ADSCs，經過傳代培養(yǎng)ADSCs的純度可以得到進一步的提高，ADSCs表達特異的表面分子，具有極強的自我更新能力和多向分化潛能。