大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療彌漫性泛細支氣管炎作用機理探討.pdf

1、前言：以紅霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類分子中含內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的大環(huán)而得名的抗生素，這個內(nèi)酯環(huán)通常為12-20元環(huán)，也可更多，最初的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是從鏈霉菌分離出來，此后在其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上陸續(xù)研究開發(fā)出一系列抗菌活性強，不良反應(yīng)少的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，如羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素等，其主要抗菌機制是阻礙細菌蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抑菌或殺菌作用。自從工藤翔二等學(xué)者首先報道長期小劑量紅霉素治療彌漫性泛細支氣管炎(diffusepanbronchio

2、litis，DPB)取得明顯效果以來，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗炎活性逐漸成為研究熱點。
　　 在DPB患者支氣管肺泡灌洗液(Bronchioalveolar Lavage Fluid，BALF)中，T淋巴細胞絕對數(shù)明顯高于正常對照組，DPB組織病理特點是淋巴細胞、漿細胞及組織細胞等浸潤致管壁增厚，伴有支氣管相關(guān)淋巴組織(bronchus-associatedtissue，BALT)增生，明顯高于其它呼吸道疾病，加之肉芽組織及瘢痕灶的

3、形成致呼吸性細支氣管壁增厚、管腔狹窄和閉塞，繼而引發(fā)細支氣管擴張。DPB病理結(jié)果顯示，除中性粒細胞外，淋巴細胞在DPB發(fā)生和發(fā)展過程中也是十分重要的細胞成分。T細胞可通過分泌多種與炎癥形成有關(guān)的細胞因子，如TNF-α、白細胞介素IL-2和IL-1等細胞因子，同時，T淋巴細胞自身也可分泌一種趨化多種炎性細胞的趨化性細胞因子-巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatoryprotein-1α，MIP-1α)[18，2

4、3]，所產(chǎn)生的細胞因子反過來又可激活淋巴細胞，免疫活化的淋巴細胞分別產(chǎn)生淋巴因子或抗體，造成炎癥反應(yīng)周而復(fù)始，連綿不斷，呈慢性經(jīng)過，故T淋巴細胞對DPB的發(fā)生和病理的持續(xù)性進展起著重要作用，并且已有研究表明DPB患者存在T淋巴細胞凋亡不足的現(xiàn)象。
　　 MIP-1α是T淋巴細胞及多種炎性細胞分泌的一種趨化性細胞因子，能趨化多種炎性細胞，其在激活淋巴細胞，促使其黏附于血管內(nèi)皮而遷移和建立化學(xué)趨化梯度的過程中起著重要作用。已有研究表

5、明在DPB患者BALF中MIP-1α明顯高于正常對照組。
　　 鑒于T淋巴細胞及其分泌的趨化性細胞因子-MIP-1α在炎癥反應(yīng)中的重要作用，我們將其引入DPB的系列研究，比較十四元環(huán)紅霉素(erythromycin，EM)和十五元環(huán)阿奇霉素(azithromycin，AZM)對T淋巴細胞增殖和MIP-1α表達的影響，以探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療DPB的作用機理。
　　 實驗方法
　　 第一部分基礎(chǔ)實驗部分
　

6、　 1、EM和AZM對T淋巴細胞MIP-1α表達的影響：用10％胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)DMEM培養(yǎng)液(100u/mL青霉素，100μg/ml鏈霉素)體外培養(yǎng)人T淋巴細胞(Jurkat T cell)，各孔中加入5種濃度(6.25、12.5、25、50和100μg/mL)的紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide，DMSO：終濃度<0.1％)中并設(shè)立陰性對照孔培養(yǎng)2

7、4h后，收集細胞采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)方法測定MIP-1αmRNA的表達，上清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)進行MIP-1α蛋白的測定。
　　 2、EM和AZM對T淋巴細胞調(diào)亡的影響：用10％胎牛血清(fetal bovi

8、neserum，F(xiàn)BS)RPMI1640(100u/mL青霉素，100μg/ml鏈霉素)體外培養(yǎng)人T淋巴細胞(Jurkat T cell)，按照12.5μg/mL、100μg/mL和200μg/mL3種濃度分別加入紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于DMSO(終濃度<0.1％)，同時設(shè)立只加DMSO而不加上述藥物的陰性對照孔培養(yǎng)48h。采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測淋巴細胞凋亡，Western blotting法檢測

9、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)處理：實驗重復(fù)次數(shù)≥3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS12.0軟件包的配對t檢驗進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 第二部分臨床病例研究部分
　　 EM和AZM對DPB患者T淋巴細胞調(diào)亡的影響：(1)、分離DPB患者外周靜脈淋巴細胞及體外培養(yǎng)：收集初次診斷的DPB病例(未應(yīng)用過紅霉素及阿奇霉素等相關(guān)藥物)，抽取新

10、鮮外周靜脈血于無菌肝素鋰抗凝血試劑管中，2小時內(nèi)體外采用淋巴細胞分離液無菌過程分離淋巴細胞并將細胞用10％FBS細胞培養(yǎng)液(100u/mL青霉素，100μg/ML鏈霉素)稀釋培養(yǎng)。(2)、觀察EM和AZM對DPB患者T淋巴細胞調(diào)亡的影響：按照12.5μ/mL、100μ/mL和200μg/mL3種濃度分別加入紅霉素或阿奇霉素，兩種藥物溶解于DMSO(終濃度<0.1％)，同時設(shè)立只加DMSO而不加上述藥物的陰性對照孔培養(yǎng)48h。采用流式細胞

11、儀Annexin V-FITC/PI法檢測淋巴細胞凋亡，Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達。(3)、統(tǒng)計學(xué)處理：實驗重復(fù)次數(shù)≥3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS12.0軟件包的配對t檢驗分析進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果
　　 一、基礎(chǔ)實驗結(jié)果
　　 1、EM和AZM對T淋巴細胞MIP-1α表達的影響：RT-PCR

12、結(jié)果顯示紅霉素或阿奇霉素均可抑制MIP-1α的mRNA相對表達(P<0.05)。阿奇霉素和紅霉素在12.5μg/mL時的表達水平降低較明顯，陰性對照組MIP-1α的mRNA相對表達值1.094±0.08，阿奇霉素作用后MIP-1αmRNA相對表達值0.91±0.09，紅霉素作用后MIP-1αmRNA相對表達值0.96±0.06。ELISA實驗結(jié)果顯示各化合物上清液MIP-1α蛋白表達與陰性對照組比較均有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

13、5)，其中在12.5μg/mL時蛋白水平的表達降低較明顯，阿奇霉素使MIP-1α下降41％，紅霉素使之降低35％。
　　 2、EM和AZM對T淋巴細胞調(diào)亡的影響：流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測顯示，紅霉素(100μg/mL和200μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL和200μg/mL)有誘導(dǎo)細胞凋亡活性(P<0.05)，其中阿奇霉素較紅霉素作用明顯，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而12.5μg

14、/mL組兩抗生素未呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡(P>0.05)，從細胞凋亡角度解釋了第一部分實驗中EM和AZM在低劑量(12.5μg/mL)抑制.MIP-1α表達的作用可能與其誘導(dǎo)細胞凋亡作用無關(guān)。Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達；隨EM/AZM濃度的增加Active Caspas--3蛋白表達逐漸增加，使Bcl-2蛋白表達逐漸減少，AZM使Bax蛋白逐漸增加，而EM使Bax蛋白表達不變。
　　 二、臨床實驗結(jié)果
　　

15、EM和AZM對DPB患者T淋巴細胞調(diào)亡的影響；流式細胞儀AnnexinV/PI法檢測顯示，紅霉素及阿奇霉素對臨床初診DPB患者外周血T淋巴細胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，實驗組(100和200μg/mL)細胞凋亡率增加(P<0.05)，其中AZM較EM明顯，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，12.5μg/mL組兩抗生素未呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡(P>0.05)，基礎(chǔ)及臨床的細胞實驗均從細胞凋亡角度解釋了第一部分實驗中EM和AZM在12.51μg

16、/mL抑制MIP-α表達的作用可能與它們誘導(dǎo)細胞凋亡的作用無關(guān)。Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達顯示隨EM/AZM濃度的增加Active Caspase-3蛋白表達逐漸增加，Bcl-2蛋白表達逐漸減少，Bax蛋白表達不變。由于NF-kB在多種炎性細胞因子產(chǎn)生與釋放和炎癥細胞的凋亡中均具有重要意義，并已有文獻報道大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有抑制T淋巴細胞NF-kB活化作用，我們推測EM和AZM在12.5μg/mL抑制MIP-1α表達及

17、在100μg/mL、200μg/mL誘導(dǎo)細胞凋亡的效應(yīng)可能是通過抑制NF-kB活性實現(xiàn)的，兩種效應(yīng)可能作用的靶點不同。具體機制有待進一步研究。
　　 結(jié)論
　　 紅霉素及阿奇霉素均具有誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡的作用，其中阿奇霉素較紅霉素作用明顯。EM、AZM可使T淋巴細胞Bax/Bcl-2蛋白的比值上調(diào)，活性Caspase-3蛋白表達增加，推測AZM和EM通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達激活Caspase-3，使處理后的細

18、胞呈程序性死亡，從而對DPB患者T淋巴細胞有誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 紅霉素和阿奇霉素還可通過抑制T淋巴細胞MIP-1α的產(chǎn)生，降低對各炎性細胞包括淋巴細胞的趨化聚集，減少與DPB的病理過程密切相關(guān)的炎性細胞因子的產(chǎn)生與釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，目前尚未見到有關(guān)MIP-1α藥物抑制劑的報道，因此，大環(huán)內(nèi)酯類化合物對MIP-1α功能的影響是探索該類化合物抗炎作用機制的一個全新的切入點和角度，并為研發(fā)治療炎癥性疾病的新藥提供新的作用靶點。