慶大霉素脂質(zhì)體抗菌骨治療兔慢性感染性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、細(xì)菌生長(zhǎng)主要以浮游和貼附兩種形式進(jìn)行。細(xì)菌貼附于實(shí)體表面后一方面進(jìn)行分裂增殖，另一方面分泌胞外多糖基質(zhì)，將細(xì)菌包裹于基質(zhì)內(nèi)，形成細(xì)菌生物膜。由于胞外基質(zhì)的物理和電荷屏障以及內(nèi)部特殊的生態(tài)環(huán)境，細(xì)菌生物膜所致感染較浮游細(xì)菌更難防治，是包括慢性骨髓炎在內(nèi)的多種慢性感染性疾病的主要病因之一。一旦細(xì)菌生物膜在骨缺損周?chē)墙M織、死骨、內(nèi)固定或人工關(guān)節(jié)表面滋生，將導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的慢性骨髓炎，給患者帶來(lái)極大的痛苦。PMMA、Osteoset T在局部緩

2、釋抗生素，提高了骨髓炎的治愈率，但PMMA需二次手術(shù)取出，同時(shí)研究表明單純清創(chuàng)與清創(chuàng)后植入Osteoset T在骨髓炎的治愈率方面無(wú)明顯差異。此外，高濃度慶大霉素可抑制人成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而影響骨折愈合。慢性感染性骨缺損實(shí)際上是一種合并骨缺損的慢性骨髓炎，其主要病因仍是細(xì)菌生物膜的形成。 脂質(zhì)體是磷脂分散在水中定向排列而形成的囊泡，可包封抗生素，按表面電荷不同分為陽(yáng)離子、陰離子和中性脂質(zhì)體。研究表明，陽(yáng)離子脂質(zhì)體青霉素

3、對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)生物膜的抑制作用顯著強(qiáng)于青霉素，其機(jī)制與S.aureus生物膜帶負(fù)電荷有關(guān)；另一方面，脂質(zhì)體可使包封藥物在骨髓濃聚，因此靜脈注射脂質(zhì)體抗生素可增強(qiáng)骨感染灶局部抗生素濃度，進(jìn)而消除感染。同時(shí)，脂質(zhì)體可降低高濃度抗生素對(duì)成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用。然而人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)血液中的脂質(zhì)體具有很強(qiáng)的清除作用，大大降低了脂質(zhì)體抗生素的半衰期，削弱其抗感染能力。由于抗生

4、素緩釋系統(tǒng)可在感染灶釋放高濃度抗生素，因此，將脂質(zhì)體抗生素負(fù)載于載體在理論上可解決這一問(wèn)題。但脂質(zhì)體抗生素負(fù)載于載體后再釋放的抗細(xì)菌生物膜作用是否受到影響尚不明確。本研究首先制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素，將其負(fù)載于同種異體骨和硫酸鈣，分別進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，并探討釋放的陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素對(duì)S.aureus ATCC29213生物膜生長(zhǎng)的抑制作用，然后構(gòu)建兔慢性感染性骨缺損模型，了解S.aureus ATCC29213注射劑量對(duì)該模型的影響，并行

5、陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨對(duì)兔慢性感染性骨缺損的治療作用。此外，研究還探討了脂質(zhì)體抗生素靜脈注射對(duì)兔慢性感染性骨缺損的治療作用。 本課題包括四部分：1.S.aureus注射劑量對(duì)兔慢性感染性骨缺損形成的影響。2.脂質(zhì)體慶大霉素靜脈注射對(duì)兔慢性感染性骨缺損的治療作用。3.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨的制備以及體外對(duì)S.aureus生物膜生長(zhǎng)的抑制作用。4.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨對(duì)兔慢性感染性骨缺損的治療作用。 第一部分S.aureus注射劑量對(duì)

6、免慢性感染性骨缺損形成的影響 實(shí)驗(yàn)方法: 1.構(gòu)建兔慢性感染性骨缺損模型，制備骨缺損，微量注射器先后注入S.aureusATCC29213，注射總量分別為6x101_6x106CFU。 2.術(shù)后3w處死所有實(shí)驗(yàn)兔。計(jì)算體重變化，評(píng)估肉眼觀察評(píng)分及兔放射學(xué)改變。將兔左下肢脛骨取出進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，測(cè)量并計(jì)算平均每克標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 注射劑量達(dá)6×105CFU即可使所有實(shí)驗(yàn)兔在肉眼觀察評(píng)

7、分、放射學(xué)檢查及細(xì)菌學(xué)檢查呈現(xiàn)出明顯感染征象。 第二部分脂質(zhì)體慶大霉素靜脈注射治療免慢性感染性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)方法: 1.不同脂質(zhì)體慶大霉素的制備 三種原材料(陽(yáng)、陰離子脂質(zhì)體)或兩種(中性脂質(zhì)體)按照一定比例混合，旋轉(zhuǎn)蒸干制成脂質(zhì)膜，加入慶大霉素溶液，振蕩制成脂質(zhì)懸液，超聲處理后離心去除上清中尚未包被的慶大霉素，沉淀以ddH2O重懸制成慶大霉素脂質(zhì)體。 2.兔慢性感染性骨缺損模型的制備

8、 兔麻醉后消毒鋪巾，切開(kāi)皮膚，暴露脛骨近端骨面，制造骨缺損，骨蠟封閉，先后注入精氨酸和S.aureus ATCC29213，縫合皮膚。造模術(shù)后行大體觀察，X線檢查，X線檢查提示慢性骨髓炎后開(kāi)始治療實(shí)驗(yàn)。 3.脂質(zhì)體慶大霉素靜脈注射治療兔慢性感染性骨缺損 造模成功后分組進(jìn)行不同脂質(zhì)體慶大霉素靜脈注射治療，治療3w后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。處死前抽血、X檢查，處死后取左下肢近端脛骨骨髓行細(xì)菌學(xué)檢查。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

9、 對(duì)照組血細(xì)菌培養(yǎng)和骨細(xì)菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性；陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素治療組血培養(yǎng)均為陰性，骨培養(yǎng)4只陰性；陰離子脂質(zhì)體慶大霉素組和單獨(dú)慶大霉素治療組血培養(yǎng)呈陰性，但骨培養(yǎng)均為陽(yáng)性；中性脂質(zhì)體慶大霉素治療組血培養(yǎng)陰性，骨培養(yǎng)2只陰性； 第三部分陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨的制備及體外對(duì)葡萄球菌生物膜的抑制作用 實(shí)驗(yàn)方法: 1.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨的制備 陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素的制備與第二部分相同。無(wú)菌取兔脛骨及股骨干骺端，經(jīng)脫脂

10、、脫蛋白、脫鈣后制得兔同種異體骨。將上述同種異體骨塊及硫酸鈣浸泡至陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素溶液中，蒸干，60Co輻照消毒。 2.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨的體外釋放實(shí)驗(yàn) 將陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素抗菌骨置于微孔板，加入ddH2O，室溫振蕩。于振蕩后不同時(shí)間更換ddH2O，并將所更換出的液體以Triton X-100進(jìn)行處理，測(cè)定慶大霉素濃度。 3.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨體外對(duì)葡萄球菌生物膜的抑制作用 培養(yǎng)S.aureus A

11、TCC29213生物膜。分別取釋放實(shí)驗(yàn)中8個(gè)不同時(shí)相點(diǎn)釋放的陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素溶液，并以上述8個(gè)時(shí)相點(diǎn)的釋放濃度配制新鮮陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素、慶大霉素，將各組抗生素分別加入S.aureus ATCC29213生物膜，1h后棄去上清，加入培養(yǎng)基，并于此后每隔30min檢測(cè)每孔溶液在630nm的吸光度。計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)速率，并得出最大細(xì)菌生長(zhǎng)速率及所需時(shí)間。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素抗菌骨在釋放前期具有爆發(fā)釋放效應(yīng)

12、，且在釋放前期的特殊時(shí)間段所釋放的慶大霉素總百分比與(時(shí)間)1/2成線性關(guān)系(R2>0.9)。由陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素抗菌骨中釋放的陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素對(duì)S.aureus ATCC29213生物膜生長(zhǎng)的抑制作用與新配制的同濃度陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素?zé)o顯著差異(P>0.05)，二者在低濃度時(shí)對(duì)S.aureus ATCC29213生物膜生長(zhǎng)的抑制作用顯著強(qiáng)于單獨(dú)使用慶大霉素(P<0.01)。此外，慶大霉素對(duì)S.aureus ATCC29213的

13、MIC為230.4 mg/L。 第四部分陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨對(duì)免慢性感染性骨缺損的治療作用 實(shí)驗(yàn)方法: 1.陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨及兔慢性感染性骨缺損模型的制備與第三部分相同。 2.實(shí)驗(yàn)兔分組，進(jìn)行靜脈注射、手術(shù)清創(chuàng)植入抗菌骨治療。2w后行X線檢查，抽靜脈血行血液培養(yǎng)，處死后取局部骨髓組織行細(xì)菌學(xué)檢查。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 對(duì)照組沒(méi)有抗生素治療，均出現(xiàn)明顯感染，血液及骨髓培養(yǎng)均呈S.aureus陽(yáng)性

14、。單獨(dú)手術(shù)植入同種異體骨或硫酸鈣組評(píng)分較A組更高，但差異不顯著(P>0.05)。單獨(dú)使用慶大霉素治療2w可使兔血液培養(yǎng)陰性，且感染評(píng)分低于對(duì)照組，二者相差顯著(P<0.05)，且全部骨髓培養(yǎng)均陽(yáng)性。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素靜脈注射治療可有效清除血液感染，評(píng)分低于A、B、H、I組，且與上述4組相差顯著(P<0.05)，同時(shí)評(píng)分高于F、G組，相差顯著(P<0.05)，治療的6只兔中有2只骨髓培養(yǎng)陰性。采用慶大霉素同種異體骨和慶大霉素硫酸鈣治

15、療效果相似，低于F、G組(P<0.05)，治療的6只兔中有3只骨髓培養(yǎng)陰性。兩種陽(yáng)離子脂質(zhì)體抗菌骨療效相似，可完全清除血液、骨髓感染，感染評(píng)分低于上述各組，且相差顯著(P<0.05)。 主要結(jié)論 1.耐藥S.aureus可誘導(dǎo)明顯的脛骨感染性骨缺損形成，6×105 CFU/5ul的劑量不僅可使慢性骨髓炎模型制備成功率達(dá)100％，而且能夠出現(xiàn)較明顯的放射學(xué)和細(xì)菌學(xué)改變。 2.脂質(zhì)體慶大霉素可有效治療慢性感染性骨缺損

16、，其中以陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素效果最為明顯，中性次之，陰離子脂質(zhì)體慶大霉素與單獨(dú)使用慶大霉素相同，但任何一種脂質(zhì)體慶大霉素均不能完全清除感染。 3.低溫真空負(fù)壓吸引法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素抗菌骨并不影響所釋放的陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素對(duì)S.aureus生物膜的抑制作用，且在低濃度對(duì)S.aureus生物膜抑制顯著強(qiáng)于單獨(dú)使用慶大霉素。 4.手術(shù)清創(chuàng)后植入陽(yáng)離子脂質(zhì)體慶大霉素抗菌骨對(duì)兔脛骨S.aureus慢性感染性骨缺損的治療效