卡介苗（BCG）、卡介苗提取物和Ag85B免疫調(diào)節(jié)機制及抗小鼠膀胱癌作用的研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，具有多發(fā)性和易復發(fā)等特點，70％-80％為淺表性膀胱癌。據(jù)文獻報道，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(TURBt)或膀胱部分切除術(shù)后2年腫瘤復發(fā)率達50％-70％，而且復發(fā)的病例中有10％-30％伴有惡性程度增高或浸潤能力增強。因此，術(shù)后行膀胱灌注藥物治療對于預防腫瘤復發(fā)具有重要意義。 目前常用膀胱癌腔內(nèi)治療的藥物有兩類，一類是化療藥物，如絲裂霉素、阿霉素、噻替哌等；另一類是免疫增強

2、劑，如BCG、白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(INF-γ)等?；熕幬锏母弊饔幂^少，但常引起膀胱癌細胞多藥耐藥基因的激活，高表達P-gp糖蛋白，將抗癌藥物泵出細胞外，使化療藥物藥效降低，達不到治療目的，術(shù)后復發(fā)率高，例如5年復發(fā)率噻替哌44％-51％，阿霉素33％-42％，絲裂霉素42％-49％。BCG是應用最早的腫瘤治療生物制劑，在預防膀胱癌術(shù)后復發(fā)，防止腫瘤進展作用上有顯著療效，治療淺表性膀胱癌術(shù)后五年復發(fā)率僅為18.9％。此外

3、BCG還有治療作用，對殘留小腫瘤有效率為50％-60％，對原位癌的完全有效率為70％-75％，引起5年以上持久緩解的總有效率平均為70％。把BCG直接灌入上部集合系統(tǒng)，可有效治療上泌尿道移行細胞癌。 本實驗通過對BCG進行分離和純化，得到抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的有效成分和Ag85B，并對BCG、BCG有效成分和Ag85B的免疫調(diào)節(jié)活性及抗小鼠膀胱的治療作用進行分析，旨在尋求治療膀胱癌的更佳藥物，這對膀胱癌的治療有重要意義。本實驗分三部

4、分進行。 第一部分BCG對小鼠體外脾淋巴細胞增殖及細胞因子產(chǎn)生作用的研究 目的：通過BCG對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以及誘導小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的作用來探討B(tài)CG的免疫調(diào)節(jié)活性。 方法：1.采用MTT法測定不同濃度的BCG對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用。2.采用ELISA方法檢測經(jīng)過不同濃度BCG作用后誘導小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細胞因子的含量。 結(jié)果：體外增殖實驗表明：在體

5、外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞中加入濃度為3.6×103cfu/ml以下的BCG時，對小鼠脾淋巴細胞的促增殖作用不明顯，其PI值為1.02。而加入濃度為3.6×103cfu/ml的BCG時，則可以明顯促進小鼠脾淋巴細胞的增殖(P＜0.01)，而且，這種促進作用隨著BCG濃度的增加而顯著增強。在BCG濃度為3.6×106cfu/ml時促增殖作用最強，PI值達到6.82。 結(jié)論：1.BCG對于小鼠脾淋巴細胞的增殖具有促進作用，這種作用具有一

6、定的劑量效應關(guān)系。2.BCG能夠刺激小鼠脾淋巴細胞分泌多種細胞因子，如IL-2、TNF-α和INF-γ等。這種作用也同樣具有一定的劑量效應關(guān)系。 第二部分BCG有效成分及Ag85B免疫調(diào)節(jié)機制的實驗研究 目的：提取、分離、純化并且鑒定BCG的有效成分及Ag85B，分析BCG不同成分及Ag85B對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用及誘導小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生細胞因子的作用，探討其有效組分及Ag85B的免疫調(diào)節(jié)活性。 方法：采用酶

7、裂解法和超聲波破碎法對BCG進行裂解，提取其活性蛋白成分。2.采用紫外吸收比色法測定提取蛋白的純度；應用考馬斯亮蘭G250方法測定提取物的蛋白含量。3.采用葡聚糖凝膠層析方法對BCG提取物進行組分分離。采用SDS-PAGE凝膠電泳方法對層析后的BCG提取物進行純度及分子量的鑒定。4.將構(gòu)建的pGESAg85B/BL21活化后接種于LB培養(yǎng)基中，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組蛋白的表達，包涵體變性后經(jīng)梯度濃度尿素復性,GSTSep

8、harose親和層析、凝血酶切除GST并再次親和層析純化得到純化的Ag85B蛋白。5.采用MTT法測定BCG有效提取成分及Ag85B對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用，同時采用ELISA方法檢測經(jīng)過BCG有效提取成分及Ag85B誘導作用后小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2、TNF-α、INF-γ等細胞因子的含量。 結(jié)果：1裂解BCG提取其活性蛋白成分。經(jīng)過紫外吸收比色方法測定BC裂解成分的蛋白純度A280nm/A260nm為1.71；采用考馬斯

9、亮蘭G250方法測定提取物總蛋白含量為9.8mg/ml。 第三部分BCG、BCGE2及Ag85B對小鼠膀胱癌的治療及機制的研究 目的：膀胱移行細胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，其復發(fā)率高一直是困擾臨床醫(yī)生的嚴重問題，因此，尋找一種有效的藥物來控制腫瘤生長，降低復發(fā)率對膀胱癌的治療至關(guān)重要。BCG被認為是目前治療膀胱癌的最有效的藥物，但存在許多不良反應。Ag85B是BCG的重要成分之一，是分枝桿菌最主要的分泌蛋白，能夠誘導機體

10、強烈的Th1免疫反應，并在分枝桿菌細胞壁合成中發(fā)揮重要作用，還具有與纖維粘連素相結(jié)合的特性。該蛋白能夠誘導Th1型免疫細胞分泌IL-2、TNF-α和INF-γ等細胞因子。本實驗通過檢測BCG及其相關(guān)成分對免疫細胞產(chǎn)生各種細胞因子的作用，觀察抑瘤率和荷瘤小鼠生存期，分析腫瘤細胞壞死和凋亡情況，對BCG、BCGE2及Ag85B對小鼠膀胱移行細胞癌作用效果及機制作初步探討，旨在為尋求對膀胱癌治療的更佳藥物提供一定的依據(jù)。 材料與方法：

11、 1小鼠可移植性膀胱細胞癌動物模型的建立。 1.1BTT739膀胱移行細胞癌株由上海市第一人民醫(yī)院病理科提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代分瓶，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。T739小鼠由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所提供，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)。 1.2T739近交系小鼠4～6周齡共48只，體重18～22克，隨機平均分為四大組，雌雄各半。每大組平均分為兩小組，雌雄各半。每只小鼠右側(cè)腋下皮下注射濃度為5.0×106/ml的BTT7390.

12、1ml。 2藥物干預膀胱移行細胞癌的生長。各組小鼠分別于接種膀胱癌細胞的第1天、第5天、第9天、第13天、第17天、分別在腫瘤結(jié)節(jié)周圍注射生理鹽水、BCG、BCGE2及Ag85B。生理鹽水組作為對照組，其他組作為治療組。第18天每大組隨機處死1小組，處死組取血離心分離血清并解剖瘤組織稱重，根據(jù)瘤重計算抑瘤率：抑瘤率(％)=(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)×100％。瘤組織分3部分，分別行病理檢查、電鏡和流式細胞分析。另

13、1小組觀察荷瘤鼠觀察生存期，并計算存活延長率。存活延長率(％)=(治療組平均存活天數(shù)/生理鹽水組平均存活天數(shù)-1)×100％。 結(jié)果： 1.1處死小鼠解剖瘤組織稱重，生理鹽水組、BCG組、BCGE2組及Ag85B組T739瘤小鼠的平均瘤重分別為(6.67±1.54)g、(4.24±1.19)g、(3.90±1.58)g、(2.80±1.05)g。后三組平均抑瘤率分別為36.43％、41.52％、58.02％。生理鹽水組荷

14、瘤小鼠平均瘤重明顯高于其余三組，差別有顯著性(P＜0.05)；Ag85B處理組荷瘤小鼠平均瘤重明顯低于其它兩組，其差別有顯著性(P＜0.05)。其余兩組之間無差別。 1.2生理鹽水、BCG、BCGE2、及Ag85B處理后各組小鼠的平均生存期分別為18.58±1.83天、24.42±5.51天、25.12±4.64天、30.25±5.43天。生理鹽水組荷瘤小鼠平均生存期明顯低于其余三組，差別有顯著性(P＜0.05)；其余三組中Ag

15、85B組明顯長于其余兩組，差別有顯著性(P＜0.05)，余兩組之間無差別。各治療組荷瘤小鼠存活延長率依次為31.43％、35.20％、62.81％。 2.1ELISA法檢測各組小鼠血清的IL-2濃度。生理鹽水組IL-2濃度明顯低于其他三組，差別有顯著性(P＜0.05)，Ag85B組IL-2明顯高于其他三組，差別有顯著性(P＜0.05)，BCG組、BCGE2組之間無統(tǒng)計學差別。 2.2各組小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量

16、。生理鹽水組明顯低于其余三組，差別有顯著性(P＜0.05)，其余三組中Ag85B組TNF-α和IFN-γ含量明顯高于其它兩組，差別有顯著性(P＜0.05)，BCG組、BCGE2組之間統(tǒng)計學上無差別。 結(jié)論：1BCG、BCGE2及Ag85B均能夠明顯抑制腫瘤生長，延長荷瘤鼠生存期，其中Ag85B的效果最好。 2BCG、BCGE2及Ag85B均能使荷瘤鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ濃度升高。其中Ag85B對小鼠細胞因