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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景和目的: 近期研究指出血管內(nèi)皮功能障礙(Endothelial dysfunction, ED)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)發(fā)生和加重的重要基礎(chǔ)或起始事件,也是糖尿病血管病變發(fā)生的主要原因,假性血友病因子(vonWillebrand factor, vWF)、內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是檢測(cè) ED的兩個(gè)重要指標(biāo)。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙主要特征之一表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞異常凋亡。細(xì)胞凋亡(apop
2、tosis),亦稱為程序化的細(xì)胞死亡(Programmed cell death,PCD),是一種不同于細(xì)胞壞死的生理性或者病理性的死亡過程。研究證實(shí),在高糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中細(xì)胞凋亡起著重要的作用,因此,防治高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有著重要意義。2型糖尿病(diabetes mellitus type2,T2DM)血管內(nèi)皮功能紊亂與蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)活性
3、受到抑制有關(guān)。Akt是體內(nèi)重要的凋亡抑制蛋白,介導(dǎo)了腫瘤、糖尿病等多種疾病的病理過程,通過Thr308和Ser473位點(diǎn)磷酸化使Akt激活,進(jìn)而磷酸化底物調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞代謝。
實(shí)驗(yàn)證明,NO-1886具有很強(qiáng)的活化脂蛋白脂酶的作用,它能夠提高動(dòng)物脂肪、心肌和骨骼肌組織中 LPLmRNA的表達(dá)和LPL活性,可提高血漿 LPL活性30~40%,降低血糖、血漿三酰甘油,升高高密度脂蛋白膽固醇水平;促進(jìn)脂質(zhì)氧化,能抑制脂質(zhì)蓄積,減
4、輕胰島素抵抗,降低血漿葡萄糖濃度,抑制糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化病變。本研究通過體外培養(yǎng)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞這個(gè)平臺(tái),從細(xì)胞和分子水平,觀察NO-1886對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是否有保護(hù)作用,研究高糖環(huán)境下NO-1886對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用是否與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān),并探討NO-1886抗凋亡的分子機(jī)制。
方法: 體外培養(yǎng),利用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。用普通光鏡和Hoechst33258熒光染色觀察H
5、UVECs細(xì)胞形態(tài)和核形態(tài)的變化;Annexin V和PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡定量;用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Akt、ET-1、vWF mRNA的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ET-1、vWF蛋白水平的改變;用Western blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Akt總蛋白表達(dá)及Akt-Thr308及Akt-Ser473的磷酸化水平。
結(jié)果: (1)與對(duì)照組細(xì)胞比較,用不同濃度高糖處理HUVECs細(xì)胞72小時(shí)
6、后,普通光學(xué)顯微鏡下觀察到,細(xì)胞數(shù)目減少,圓形細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞邊界不清;Hoechst33258染色結(jié)果表明有細(xì)胞核濃縮、呈高亮度藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡率顯著增加;細(xì)胞 ET-1、vWF mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào);Akt磷酸化水平下降。(2)不同濃度的NO-1886對(duì)體外高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和Akt的活性及ET-1、vWF的表達(dá)有著不同的影響:低濃度(2,4,8μmol/L)NO-1886短時(shí)
7、間(6,12,24,48h)處理可抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,增加Akt的活性,顯著降低ET-1、vWF mRNA及蛋白表達(dá);而高濃度(32mol/L) NO-1886及長(zhǎng)時(shí)間(72h)處理則進(jìn)一步降低Akt的活性,加重高糖的細(xì)胞毒性作用。(3)PI3K阻斷劑LY294002可抑制NO-1886的抗凋亡作用,減弱NO-1886對(duì)Akt的磷酸化。(4)NO-1886對(duì)Akt mRNA及其總蛋白表達(dá)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
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