骨化三醇對缺氧腎小管上皮細胞的保護作用及其抗腎纖維化機制的研究.pdf

1、目的:通過觀察骨化三醇對缺氧誘導的腎小管上皮細胞(Humankedneyproxiamal tubular cells-2，HK-2)的影響，探討骨化三醇對腎小管上皮細胞的保護作用及其通過腎小管上皮細胞途徑改善腎纖維化的可能機制。
　　方法:
　　1人腎小管上皮細胞的培養(yǎng):人腎小管上皮細胞株(HK-2)，在37℃、5％CO2、飽和濕度下用含10％胎牛血清的DMEM/F121∶1培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HK-2細胞分為5組:①空白對照組

2、;②氯化鈷刺激組;③氯化鈷+10-10mol/L骨化三醇高劑量組;④氯化鈷+10-11mol/L骨化三醇中劑量組;⑤氯化鈷+10-12mol/L骨化三醇低劑量組。
　　2采用MTT法觀察骨化三醇對氯化鈷刺激人腎小管上皮細胞增殖能力的影響。
　　3采用Annexin V/PI雙染法流式細胞術分析骨化三醇對各實驗組人腎小管上皮細胞凋亡率的影響。
　　4采用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immnosorben

3、t assay，ELISA)檢測各組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF、MCP-1、TGF-β的含量。
　　5采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測各組細胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA的表達水平。
　　6采用免疫印跡(Western Blot)法檢測各組ICAM-1蛋白的表達水平。
　　結果:
　　1骨化三醇

4、對經氯化鈷誘導的HK-2細胞增殖的影響
　　低氧可明顯抑制HK-2細胞增殖，細胞培養(yǎng)液中骨化三醇的終濃度為10-11mol/L時，HK-2細胞增殖最明顯，與氯化鈷刺激組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。
　　2骨化三醇對經氯化鈷誘導的HK-2細胞凋亡的影響
　　氯化鈷刺激組細胞凋亡率明顯升高，與空白對照組相比，有統計學意義(P＜0.05）。經不同劑量骨化三醇作用24h后，各組HK-2細胞凋亡率顯著下降，與氯化鈷刺

5、激組比較，差異有統計學意義(P＜0.05），骨化三醇低劑量組與高中劑量組有統計學差異(P＜0.05)。
　　3骨化三醇對經氯化鈷誘導的HK-2細胞VEGF、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達的影響
　　氯化鈷刺激組MCP-1、ICAM-1 mRNA表達較空白對照組顯著升高（P＜0.05），而VEGF mRNA表達較空白對照組相比升高不明顯(P＞0.05)。經骨化三醇作用24h之后，與氯化鈷刺激組相比，HK-2細胞MCP-

6、1、ICAM-1mRNA的表達明顯抑制（P＜0.05），而VEGFmRNA的表達顯著升高(P＜0.05）?？瞻讓φ战M中VEGF、MCP-1、ICAM-1mRNA均有基礎量表達。
　　4骨化三醇對經氯化鈷誘導的HK-2細胞上清液中VEGF、TGF-β、MCP-1含量影響
　　氯化鈷刺激組MCP-1、TGF-β的含量較空白對照組升高(P＜0.05），而VEGF與空白對照組升高不明顯（P＞0.05）。經骨化三醇作用24h后，HK-

7、2細胞MCP-1、TGF-β的表達水平降低，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05)。HK-2細胞VEGF的含量升高，與氯化鈷刺激組相比(P＜0.05)?？瞻讓φ战M中VEGF、MCP-1、TGF-β均有基礎量水平表達。
　　5骨化三醇影響氯化鈷誘導的HK-2細胞ICAM-1的蛋白表達氯化鈷刺激組ICAM-1蛋白與空白組相比明顯升高（P＜0.05），經骨化三醇作用24h后與氯化鈷刺激組相比ICAM-1蛋白明顯下降（P＜0.05），以10-

8、11mol/L組最為明顯。
　　結論:
　　1骨化三醇具有抑制氯化鈷誘導的HK-2細胞增殖活力下降和凋亡的作用。顯示了骨化三醇對HK-2細胞的缺氧損傷保護作用。
　　2骨化三醇可減少氯化鈷誘導的HK-2細胞趨化因子(MCP-1)、黏附因子(ICAM-1)和轉化生長因子(TGF-β)表達，促進血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達。結果顯示骨化三醇通過對缺氧狀態(tài)下腎小管上皮細胞產生的炎性因子和強促纖維化因子的抑制作用及其上