馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA應用研究.pdf

1、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata(Say)，又稱科羅拉多甲蟲或科羅拉多馬鈴薯葉甲，屬于鞘翅目的葉甲科，是世界性檢疫害蟲之一。自20世紀90年代傳入我國新疆地區(qū)以來，對我國的馬鈴薯生產構成了嚴重威脅。本試驗通過測試表達馬鈴薯甲蟲腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA(dsSAHase)的大腸桿菌對馬鈴薯甲蟲的干擾作用，研究儲存條件對大腸桿菌菌液的影響，并初步探討馬鈴薯甲蟲體液對dsRNA的降解作用以及穩(wěn)定劑的開發(fā)。研究

2、結果對利用RNA干擾技術開發(fā)高效、專一性強、對人畜安全、對環(huán)境無污染的新型殺蟲劑具有一定意義。本研究主要內容包括：
　?、興sSAHase對馬鈴薯甲蟲 RNA干擾效應試驗結果：通過飼喂法將不同劑量dsSAHase導入馬鈴薯甲蟲體內，運用線性回歸方法測算各齡期 LC50；同時觀測飼喂后成蟲的產卵數(shù)，解剖觀察雌成蟲卵巢發(fā)育情況。dsSAHase對馬鈴薯甲蟲各齡期幼蟲的的LC50分別為：1齡2.341μg/ml，2齡2.552μg/ml

3、，3齡3.450μg/ml，4齡4.968μg/ml。飼喂dsSAHase后，馬鈴薯甲蟲成蟲表現(xiàn)為產卵極少或不產卵，其雌成蟲卵巢發(fā)育等級與產卵情況正相關。dsSAHase對馬鈴薯甲蟲幼蟲具有顯著致死作用、拒食作用以及抑制生長發(fā)育作用，各齡期幼蟲的毒力隨齡期增長而降低，對馬鈴薯甲蟲成蟲的繁殖能力具有顯著的抑制效果。
　?、撇煌瑑Υ鏃l件對 dsSAHase生物活性的影響研究結果：將用超純水懸浮的表達dsSAHase的大腸桿菌E.coi

4、l菌體，分為滅活與不滅活兩個處理，分別于-20℃、4℃、室溫、37℃儲存24h、48h、72h，將未脫培養(yǎng)基的表達 dsSAHase的大腸桿菌發(fā)酵液不滅活，在-20℃和室溫條件下儲存24h、48h、72h；將各處理大腸桿菌飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲，檢測各因素對其活性的影響，明確其儲存條件。大腸桿菌脫培養(yǎng)基后低溫儲存24h后生物活性優(yōu)于新鮮菌，高溫儲存24h后仍有較高活性，儲存48h后效果減弱；大腸桿菌是否脫培養(yǎng)基在低溫下儲存對 dsRNA

5、活性影響不大，高溫下儲存影響較大；大腸桿菌脫培養(yǎng)基后儲存則溫度、是否滅活對活性影響不大。dsRNA大腸桿菌菌體在-20℃、4℃、室溫、37℃條件下可以在24h內儲存。
　　⑶馬鈴薯甲蟲體液對dsRNA的降解作用及聚乙烯亞胺（PEI）對dsRNA的保護作用試驗結果：馬鈴薯甲蟲中腸液及淋巴液與dsSAHase在不同溫度條件下體外孵育，觀測其作用結果；構建聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)PEI-dsSAHase

6、復合物，飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲，觀測PEI對dsSAHase的增效作用。馬鈴薯甲蟲中腸液與淋巴液都降解dsSAHase，該降解作用受溫度影響較小。單體dsSAHase菌液飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲死亡率為55％，而PEI-dsSAHase復合物飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲死亡率達到75%。dsRNA會被馬鈴薯甲蟲體液部分降解，而PEI與dsRNA結合形成復合物，提高了dsRNA的穩(wěn)定性，抑制了dsRNA在蟲體內的降解。馬鈴薯甲蟲腺苷高半胱氨酸水解