Ⅲ型鈉通道SCN3A基因啟動子區(qū)c-Fos轉錄調控元件的功能分析.pdf

1、背景：Ⅲ型鈉離子通道α亞基編碼基因SCN3A的表達存在時空特異性，并受嚴格的調控。它主要在胚胎和新生期中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高表達，出生后明顯減少。癲癇、精神發(fā)育遲滯、孤獨癥、脊髓損傷后產(chǎn)生的神經(jīng)病理性疼痛等神經(jīng)系統(tǒng)疾病與SCN3A基因表達異常有關。該基因的啟動子及其轉錄調控元件的異常調控很可能是導致病理情況下 Nav1.3表達增多的原因。c-Fos是一種真核生物早期基因表達調控的轉錄因子，在人及哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。c-

2、Fos對鈉通道基因的表達調控迄今還未見報道。
　　目的：本研究通過鑒定 hSCN3A基因啟動子和上游轉錄調控區(qū)域，以及通過生物信息學分析hSCN3A基因的轉錄調控元件，體外證實c-Fos調控元件的生理功能，以期進一步探討SCN3A基因時空表達調控的分子機理及其與癲癇發(fā)生和發(fā)展的相關性。
　　方法：本課題組前期已經(jīng)成功構建 hSCN3A基因啟動子與熒光素酶報告基因pGL4.10的系列重組質粒，現(xiàn)采用5′端截短方法構建不同長度的

3、hSCN3A基因啟動子與熒光素酶報告基因pGL4.10的系列重組質粒，通過轉染NGF誘導的PC12細胞后，根據(jù)雙熒光報告系統(tǒng)測定的相對熒光素值，統(tǒng)計分析 hSCN3A基因啟動子和上游調控區(qū)域的相關功能。利用生物信息學分析 hSCN3A基因轉錄起始點和上游序列的特征并預測與之相關的調控元件，選擇預測的c-Fos調控元件進行功能研究。采用定點誘變的方法對c-Fos調控元件位點進行缺失突變，構建缺失突變后熒光素酶報告基因表達載體（PGL4-F

4、1.1-cFos-del），分別轉染PC12細胞和NGF誘導的PC12細胞后，根據(jù)雙熒光報告系統(tǒng)測定的相對熒光素值，統(tǒng)計分析調控元件的功能。為研究轉錄因子與調控元件的結合，構建轉錄因子的表達質粒，并在編碼轉錄因子序列前端插入編碼V5標簽蛋白的序列，采取Western Blot實驗證明融合蛋白的表達。合成生物素標記的帶有調控元件的DNA探針，采取凝膠阻滯的電泳遷移實驗，分析探針與蛋白的結合情況。
　　結果：
　　1. hSCN

5、3A基因最小功能啟動子及其上游轉錄調控區(qū)的鑒定
　　對hSCN3A基因啟動子不同長度片段（F0.9、F0.7、F0.5、F0.3、F0.2、F0.1）的分析表明，F(xiàn)0.9和F0.7與F1.1比較，相對熒光素酶活性分別下降約30％和80%，這兩個區(qū)域為正性調控區(qū)域，該區(qū)域可能存在正性調控元件；在轉錄起始點上游-548到+174 bp區(qū)活性改變不明顯,為最小功能啟動子。
　　2. hSCN3A基因啟動子區(qū)潛在的轉錄調控元件

6、>　　使用軟件預測 hSCN3A基因啟動子轉錄起始點上游的正性調控區(qū)域內的轉錄調控元件，發(fā)現(xiàn)了多個潛在的轉錄調控元件，同時我們選取預測的c-Fos轉錄調控元件進行后續(xù)的功能研究。
　　3. hSCN3A基因啟動子區(qū) c-Fos轉錄調控元件上調報告基因表達，且需要 NGF參與
　　通過對c-Fos轉錄調控元件敲除質粒的活性分析，在PC12細胞中，野生型質粒的活性與NGF誘導的PC12細胞相比較下降40%，而c-Fos del質

7、粒無差異；在NGF誘導的PC12細胞中，c-Fos del質粒的活性與野生型質粒相比較下降50%，而在PC12細胞中c-Fos del質粒與野生型質?；钚詿o差異。結果表明，在PC12細胞中，只有在NGF誘導條件下，c-Fos元件才能顯著性上調hSCN3A基因啟動子活性。
　　4. NGF上調PC12細胞內源Scn3a基因表達的影響
　　使用RT-PCR和熒光定量PCR的方法對PC12細胞的內源Scn3a基因表達進行分析，RT

8、-PCR結果顯示，在NGF誘導情況下，PC12細胞的內源 Scn3a基因 PCR的條帶濃度明顯較無NGF時高，同時熒光定量PCR顯示，在NGF誘導情況下，PC12細胞的內源Scn3a的轉錄本明顯較無NGF時高，上述結果表明NGF能上調PC12細胞內源性Scn3a基因表達。
　　5. c-Fos蛋白與轉錄調控元件不直接結合
　　為研究c-Fos與調控元件是否直接結合，本研究首先構建V5-c-Fos融合表達載體，并采用Weste

9、rn Blot實驗證明異源表達的融合蛋白V5-c-Fos是否被運至細胞核。采取凝膠阻滯的電泳遷移實驗，觀察 V5-c-Fos蛋白與轉錄調控元件的DNA片段的結合，結果顯示V5-c-Fos蛋白并未與調控元件直接結合。提示c-Fos蛋白可能以間接方式與轉錄調控元件結合。
　　結論：本研究鑒定了人SCN3A基因的最小功能啟動子及其上游調控區(qū)的功能，發(fā)現(xiàn)在轉錄起始點上-558到-549 bp范圍內存在一個有功能的c-Fos調控元件，該元件