整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在調控結腸癌細胞遷移中的作用及分子機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景和意義:
   結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,隨著我國人民生活水平的提高和飲食結構的改變,結腸癌的發(fā)病率有逐年增高的趨勢,雖然近年來醫(yī)療診治水平有了很大的提高,但其死亡率仍居高不下,僅次于肺癌和肝癌,占我國惡性腫瘤死亡率第三位,嚴重危害人民群眾健康。
   整合素屬于黏附分子家族,是一類由α、β亞單位以非共價鍵結合組成的跨膜糖蛋白受體,介導細胞間及細胞與細胞外基質的黏附作用,通過細胞內外信號傳導促進細胞增殖

2、、分化、侵襲和轉移。整合素在細胞遷移中的作用主要是通過其與細胞外基質配體不斷的連接與解離實現(xiàn),直接介導細胞的定向遷移過程。整合素αvβ6是一類只表達于惡性上皮性腫瘤組織而在正常及良性腫瘤組織不表達的特殊整合素亞型,在腺上皮來源消化道腫瘤如結直腸癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌中高表達;鱗狀上皮來源腫瘤如肺癌、口腔鱗狀上皮癌亦可見其表達;且主要表達于腫瘤侵襲邊緣,與多種腫瘤的惡性行為密切相關。
   我們在前期研究發(fā)現(xiàn),整合素αvβ6的表

3、達與結腸癌病理類型、分化程度、TNM分期密切相關,整合素αvβ6陽性表達患者生存期明顯縮短,可作為結腸癌獨立的不良預后指標;體外細胞實驗證實整合素αvβ6的表達可以提高結腸癌細胞增殖、侵襲能力,并在一定程度上提高結腸癌細胞抵御凋亡、對抗化療藥物的能力;我們發(fā)現(xiàn)在整合素β6亞單位與ERK2之間存在直接連接,并明確了β6胞內段與ERK2的結合位點(746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764,下劃線處表示兩者結合位點),與整合素β6連

4、接的ERK2分子的磷酸化水平更高,提示這種連接可能在一定程度上使ERK2分子發(fā)生構象改變,從而更容易被磷酸化,而且能夠保護與其β6連接的ERK2分子不容易被細胞質中的磷酸酶去磷酸化而失活;不同細胞密度培養(yǎng)實驗證實,隨著結腸癌細胞密度增加伴隨有PKC活性增強和細胞表面αvβ6的表達增多,
   20世紀70年代末和80年代初,人們在研究中發(fā)現(xiàn)一些真核細胞的膜蛋白并不是靜止地存在于細胞膜上,而是在細胞亞結構中以一種動態(tài)流轉的形式存在

5、,持續(xù)進行一個內吞胞吐的循環(huán)過程,如纖連蛋白受體、LDL受體和轉鐵蛋白受體等,并逐步建立完善了這種內吞胞吐循環(huán)的檢測方法。作為一種膜蛋白受體,大量實驗證實整合素也存在這樣持續(xù)快速的內吞胞吐循環(huán)過程,而且整合素的α鏈能夠決定其是否參與內吞胞吐循環(huán)過程以及循環(huán)的速率,例如α5β1、α6β4和Mac-1等整合素都參與細胞內吞胞吐循環(huán)過程,但α3β1、α4β1和LFA-1等卻循環(huán)得很慢,或根本不存在內吞胞吐循環(huán)。2007年英國的JohnF.Ma

6、shall教授在口腔鱗狀細胞癌細胞中檢測證實了整合素αvβ6的內吞胞吐循環(huán)過程,提示整合素αvβ6在細胞內也是以這種快速循環(huán)的形式存在的。
   本課題擬在前期整合素αvβ6系統(tǒng)研究的基礎上,結合近年來整合素內吞胞吐循環(huán)的理論及實驗檢測方法,研究整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在調控結腸癌細胞惡性生物學行為中的作用,尤其是對細胞遷移能力的影響,探討整合素αvβ6-ERK2直接連接在整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)中的連接與解離狀態(tài)及所發(fā)揮的

7、作用等,為進一步深入認識整合素αvβ6在結腸癌細胞中的作用及存在形式,為今后揭示整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)調控的分子機制,并進行靶向干預治療,提供實驗依據和理論基礎。
   第一部分
   整合素αvβ6在結腸癌細胞中內吞胞吐循環(huán)檢測方法的建立
   目的
   摸索建立整合素αvβ6在結腸癌細胞中的內吞胞吐循環(huán)檢測體系。
   方法(1)內吞實驗:將結腸癌細胞在4℃下用0.2mg/ml的EZ-L

8、inkSulfo-NHS-SS-Biotin溶液對膜蛋白進行生物素標記;標記后的細胞加入含10%FBS的培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng);一定時間(5、10、15、30、60min等)后,倒出培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶迅速轉移到冰上,冷PBS沖洗2遍后,加入含有20mMMesNa的Tris緩沖溶液(pH8.6)在4℃下處理15min,去除仍存在于細胞膜上的生物素;加入20mM的碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)處理10min去除過量的MesNa;

9、收集細胞,提取蛋白,檢測蛋白濃度,進行整合素αvβ6的capture-ELISA檢測。(2)胞吐實驗:開始步驟類似于內吞實驗,只是將細胞生物素標記后,在孵箱中培養(yǎng)30min,進行一次MesNa溶液處理,再次放入孵箱中啟動胞吐過程,待指定時間(0,5,10,30min等)后,取出細胞置于冰上,第二次用MesNa溶液去除細胞表面胞吐出的αvβ6,通過capture-ELISA實驗檢測剩余未胞吐αvβ6的含量,從而判斷細胞αvβ6胞吐的時相及

10、比例。(3)Capture-ELISA:首先用5μg/ml10D5、0.05MNa2CO3(pH9.6)溶液在4℃下對96孔板進行抗體包被過夜;用含0.05%Tween-20、5%BSA的PBS-T溶液在室溫下封閉1h;將50μl細胞裂解液置入包被完成的96孔板中,在4℃下孵育過夜,進行β6的捕捉;未結合的細胞裂解產物物可以通過PBS-T大量沖洗去除;將96孔板在含有抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(streptavidin-co

11、njugatedhorseradishperoxidase)并包含1%BSA的PBS-T作用下,4℃孵育1h;加入鄰苯二胺(ortho-phenylenediamine,OPD)顯色液室溫顯色10min,加入終止液終止反應后492nm上機讀數(shù)。
   結果
   經過對內吞實驗、胞吐實驗、capture-ELISA各種實驗條件的摸索,初步構建了整合素αvβ6在結腸癌細胞中內吞胞吐循環(huán)檢測體系,加入陽性對照組與陰性對照組對

12、實驗結果的敏感性和特異性進行檢測,證實實驗結果可靠。隨即對結腸癌細胞系HT29和WiDr分別進行了整合素αvβ6內吞和胞吐檢測,發(fā)現(xiàn)在這兩種細胞中,整合素αvβ6在進行持續(xù)內吞胞吐循環(huán),內吞比例在30min達到最大值,并且通過30min時間可有70%左右的整合素αvβ6重新胞吐到細胞表面。
   結論:
   在結腸癌HT29和WiDr細胞中,整合素αvβ6持續(xù)進行內吞胞吐循環(huán),這是其一般性存在狀態(tài),它的一切生物學行為必

13、將建立在這樣的運動模式基礎上。
   意義:
   該實驗檢測體系的建立為進一步研究整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在調控結腸癌細胞惡性生物學行為中的作用及分子機制奠定了基礎。
   第二部分整合素αvβ6-ERK2直接連接對αvβ6內吞胞吐循環(huán)的影響
   目的
   探討整合素αvβ6-ERK2直接連接對αvβ6內吞胞吐循環(huán)的影響。
   方法
   利用MAPK信號傳導通路中ERK

14、2上游MEK的抑制劑PD98059處理細胞抑制ERK2磷酸化,或轉染敲除ERK2結合位點的Del.Mutantβ6入SW480細胞(αvβ6陰性表達),利用內吞實驗、胞吐實驗檢測在這種狀態(tài)下αvβ6內吞胞吐循環(huán)時相,與自然狀態(tài)下的αvβ6的循環(huán)時相分析比較,確定干預整合素αvβ6-ERK2直接連接對αvβ6內吞胞吐循環(huán)的影響。
   結果
   實驗數(shù)據顯示抑制ERK磷酸化后可以抑制整合素αvβ6的內吞過程,但對其胞吐過

15、程沒有影響,同樣,敲除β6胞內段的ERK2結合位點能夠抑制αvβ6的內吞過程,但對其胞吐過程幾乎沒有影響。值得注意的是,在內吞起始5min內,敲除β6胞內段的ERK2結合位點能延緩內吞過程,但PD98059對起始5min的內吞過程沒有影響。
   結論:
   整合素αvβ6的內吞啟動過程在一定程度上受與之直接連接的ERK2磷酸化程度的影響,而且與ERK2連接,尤其是與磷酸化ERK2的連接,可以促進整合素αvβ6的內吞過

16、程的啟動。
   意義:
   闡明了整合素αvβ6-ERK2直接連接在整合素αvβ6內吞胞吐過程中的作用和影響,為進一步揭示該過程的分子機制奠定了基礎。
   第三部分整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在調控結腸癌細胞遷移中的作用
   目的
   探討整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在結腸癌細胞遷移過程中的作用。
   方法
   對整合素αvβ6陽性表達的結腸癌HT29細胞給予三種手段干預

17、,分別是10D5抗體功能性阻斷αvβ6、PD98059抑制ERK磷酸化、primaquine抑制胞內空泡運輸,通過遷移實驗觀察細胞在纖連蛋白表面遷移能力的改變;另外,向整合素αvβ6陰性表達的結腸癌SW480細胞分別轉染wild-typeβ6、Del.Mutantβ6和空載體,觀察這三種細胞遷移能力的差別,同樣對三種細胞給予10D5抗體、PD98059和primaquine處理,觀察對三種細胞遷移能力影響的不同。
   結果

18、r>   實驗結果顯示,10D5抗體、PD98059和primaquine均能夠抑制HT29細胞在纖連蛋白表面的遷移能力;SW480wild-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三種細胞在纖連蛋白表面的遷移能力明顯不同,SW480wild-typeβ6細胞明顯強于另外兩種細胞,提示整合素αvβ6及αvβ6-ERK2直接連接在結腸癌細胞遷移過程中發(fā)揮重要作用;對SW480wild-typeβ6、SW480

19、Del.Mutantβ6、SW480mock三種細胞分別給予10D5抗體、PD98059和primaquine處理,均能夠明顯抑制SW480wild-typeβ6細胞在纖連蛋白表面的遷移能力,一方面說明這種遷移能力是由整合素αvβ6介導,另一方面也說明αvβ6-ERK2直接連接、αvβ6內吞胞吐循環(huán)在其中發(fā)揮重要作用。
   結論
   結腸癌HT29細胞和SW480wild-typeβ6細胞在纖連蛋白表面的遷移主要是由

20、整合素αvβ6介導,而且在這個過程中整合素αvβ6-ERK2直接連接、整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)均發(fā)揮重要作用,在整合素αvβ6、αvβ6-ERK2直接連接、αvβ6內吞胞吐循環(huán)三個水平給予干預均可以抑制結腸癌細胞在纖連蛋白表面的遷移能力。
   意義
   證實了整合素αvβ6在結腸癌細胞遷移過程中的重要作用,并進一步揭示了整合素αvβ6-ERK2直接連接、整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在結腸癌細胞遷移過程中的作用。

21、>   第四部分
   PKC對整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)及其作用的影響
   目的
   探討PKC對整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)及其介導的細胞遷移的影響。
   方法
   首先,利用PKC激活劑PMA處理細胞,通過內吞實驗、胞吐實驗檢測PKC激活對整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)的影響,同時給予PMA和PD98059處理,觀察整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)的變化;然后,在HT29細胞或SW480wil

22、d-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三種細胞中,給予PMA處理,并結合應用10D5抗體、PD98059和primaquine等,觀察對結腸癌細胞在纖連蛋白表面遷移的影響。
   結果
   實驗結果證實,PKC激活能夠促進整合素αvβ6的內吞胞吐循環(huán),并且對內吞、胞吐過程都有加速作用;同時應用PMA和PD98059能夠在一定程度上抵消PKC激活對整合素αvβ6內吞的影響,但對整合素αv

23、β6胞吐仍有促進作用;PKC激活能夠促進結腸癌HT29細胞在纖連蛋白表面的遷移,同時應用10D5抗體、PD98059和primaquine能在一定程度上抵消這種促進作用;PKC激活能夠顯著促進SW480wild-typeβ6細胞在纖連蛋白表面的遷移能力,但對SW480Del.Mutantβ6、SW480mock細胞影響不明顯。
   結論
   PKC激活能夠加速整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán),并能提高αvβ6表達陽性結腸癌

24、細胞在纖連蛋白表面的遷移能力,而且這種促進作用是通過整合素αvβ6依賴的方式實現(xiàn)的。
   意義
   闡明了PKC在整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)及其介導的結腸癌細胞遷移過程中的作用,為進一步研究整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)的調控機制打下了基礎。
   第五部分
   高/低細胞密度培養(yǎng)對整合素αvβ6亞細胞結構分布的影響
   目的
   研究在細胞高/低密度培養(yǎng)環(huán)境下整合素αvβ6在結腸癌

25、HT29細胞表面分布情況的改變,并通過整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)理論對這個現(xiàn)象進行解釋。
   方法
   對于高、低細胞密度培養(yǎng)下的結腸癌HT29細胞,分別通過內吞實驗、胞吐實驗檢測整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)時相的差異,并利用流式細胞儀檢測不同細胞密度培養(yǎng)條件下HT29細胞表面整合素αvβ6數(shù)量改變,收集兩種狀態(tài)下的細胞,westernblot檢測細胞總蛋白中整合素αvβ6的含量,進一步對這個現(xiàn)象進行解釋。
  

26、 結果
   實驗結果證實,高密度培養(yǎng)條件下HT29細胞表面整合素αvβ6數(shù)量較多,并且高細胞密度培養(yǎng)能夠加速整合素αvβ6的內吞胞吐循環(huán)過程,而在細胞總蛋白中整合素αvβ6的總量并沒有顯著變化。
   結論
   結腸癌細胞在高密度培養(yǎng)狀態(tài)下,細胞膜上整合素αvβ6數(shù)量增多是其在細胞亞結構重分布的結果,而整合素αvβ6內吞胞吐循環(huán)在這個調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。細胞短時間內會動員胞漿內大量整合素αvβ6進入內吞

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