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文檔簡介
1、EstablishimentofVero—E6CellLineStablyEXpressingCanineDisteInperVimsReceptorNectin一4Thesissubmittedto如D內砒“厲配紀廠訓佗覘疵砂InFumⅡmentoftheRequirementfortheDegreeofMaSterOfAgrOnOmyV,YhZekunCoⅡegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicin
2、eSuperVisor:Pro£ShaⅡHuQingdaoChinaJune2014青島農業(yè)大學碩:上學位論文摘要摘要由于犬瘟熱病毒為單股負鏈的RNA病毒,在自然環(huán)境中不易存活,需要在傳代細胞中增殖以實現(xiàn)長期保存并達到人工制弱及制備疫苗的目的。但常規(guī)傳代細胞不具有介導犬瘟熱病毒侵染的特異性受體,表現(xiàn)出對犬瘟熱病毒的不敏感,需要將細胞改造使其表達感染受體以增加對犬瘟熱病毒的敏感性。本次試驗通過克隆犬瘟熱病毒受體Nectin4,在ver0E
3、6細胞中表達獲得了穩(wěn)定細胞系,為犬瘟熱病毒的進一步分離打下了基礎。為了解分析Bealge犬Nectin一4分子基因和氨基酸序列的同源性及種間保守性,試驗一根據(jù)Genebank登陸的已有物種Nectin4序列設計引物,通過RT_PcR方法從雌性比格犬胎盤和肺組織中成功獲得比格犬Nectin4全序列cDNA并對其進行了分析。結果顯示:Nectn4分子開放閱讀框為1530bp,編碼509個氨基酸,為典型的免疫球蛋白超家族VCC結構。經(jīng)比對分析
4、比格犬Nectin4與已公布的拉布拉多犬序列同源性為99%,物種間保守性均高于90%,且犬瘟熱病毒結合位點高度保守。將Nectin一4基因片段上下游引物5’端分別引入EcoRI酶切位點、Kozak序列及FIag標簽、SaII酶切住點,通過EcoRI、SalI雙酶切方法獲得相同的粘性末端并使用T4連接酶引入pⅡ汪S2EGFP真核表達載體中,使用5倍體積Lipfectamine蹦2000將重組質柱瞬時轉染至veroE6細胞中,通過增強型熒光
5、蛋白、間接免疫熒光方法及RT_PCR方法確定蛋白成功表達,Westemblot試驗獲得約為56kDa的目的蛋白條帶,對Vero—E6細胞多組分分別染色,確定目的蛋白在信號肽的引導作用下可以自然定位于細胞膜表面,可用于病毒侵染分離。vero—E6細胞分別使用100肛∥mIlloo陷/ml建立G418濃度梯度,選定600鵬/ml為最終工作篩選濃度。通過有限稀釋法將篩選陽性細胞單克隆化至96孔板,并進行鑒定培養(yǎng),篩選表達Nectin4蛋白的細
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