大量擴增抗原特異性活化T細胞的方法研究.pdf

1、癌癥的高發(fā)率和年輕化的趨勢已經越來越威脅到人類的健康。目前，已有的治療方法包括:外科手術切除法，放療，化療等等。但是目前這些方法都不能完全治愈癌癥，然而，過繼性免疫細胞治療為癌癥的治療帶來了新的希望。與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法不同，大多數免疫治療在消除腫瘤的過程中顯示出重要的作用，而且可以通過誘導免疫記憶來建立腫瘤與機體之間新的平衡，從根本上治愈腫瘤。免疫細胞治療技術與其他抗腫瘤策略如手術、放化療的聯合應用已經證實優(yōu)于單一的治療方案，極大拓寬

2、了細胞免疫治療。
　　過繼性免疫細胞治療是指通過輸入自身或同種異體的腫瘤殺傷細胞來治療腫瘤的方法。它不僅可以糾正細胞免疫功能的低下，促進宿主抗腫瘤免疫的功能，還可以直接發(fā)揮抗腫瘤的作用。其中細胞毒性T細胞的過繼治療有著特殊的優(yōu)越性。細胞毒性T細胞的過繼治療是實體腫瘤，尤其是腫瘤相關抗原比較明確的惡性黑色素瘤、結直腸癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究熱點。特異性CTLs（細胞毒性T細胞）的產生是通過將腫瘤抗原負載成熟的DC（樹突狀細胞

3、）刺激T細胞從而獲得單一抗原的特異性CTLs克隆。這種CTL能識別并殺傷攜帶相應腫瘤抗原的惡性細胞，經過大量的擴增就能應用于臨床治療。這種治療方法相比其他的治療方法具有易獲得、可操作性強，靶向性好，安全性高等特點。
　　但是，過繼性T細胞轉移還面臨很多的問題:DC的成熟程度低，免疫耐受，特異性活化T細胞的數量不足等等。由于DC擴增具有很大的難度，所以這也間接限制了特異性活化T細胞的數量。本文主要通過以下三個步驟建立擴增抗原特異性T

4、細胞的方法:
　　(1)用Ficoll密度梯度離心的方法從癌癥病人外周血中分離單核細胞后貼壁培養(yǎng)并將懸浮的T淋巴細胞凍存以備后續(xù)試驗之用。培養(yǎng)單核細胞時加入細胞因子FLT3L，GM-CSF，IL-4誘導分化，在培養(yǎng)第6天以MOI值為5加入Ad5-MUP53負載抗原。最后加入細胞因子TNF-α，LPS，PGE-2誘導DC成熟。
　　(2)將培養(yǎng)成熟的DC與相同人的初始T細胞以1∶10的比例共培養(yǎng)。在之后的培養(yǎng)中連續(xù)加入DC刺激

5、T細胞形成抗原特異性的活化T細胞。培養(yǎng)細胞過程中每兩天加入IL-2，IL-7，IL-15促進細胞的生長。
　　(3)將共培養(yǎng)后的T細胞轉入包被了CD3，CD28抗體的小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并進行大量擴增。培養(yǎng)細胞過程中每兩天加入IL-2，IL-7，IL-15促進細胞的生長。
　　本文通過以上三個步驟建立了能大量擴增抗原特異性活化T細胞的方法，最多能將細胞擴增至30倍左右。具體結果如下:
　　(1)我們發(fā)現擴增出的細胞中CD3

6、，CD8的陽性比例較高，說明培養(yǎng)出的細胞中T淋巴細胞的比例很高，而且CD8+的特異性活化T細胞的占有很高的比例。
　　(2)流式檢測還發(fā)現培養(yǎng)的細胞中CD4+CD25-的細胞比例很低，這說明Treg細胞的比例很低。Treg細胞是一種維持體內免疫平衡，與免疫耐受機制相關的細胞。所以較低的Treg細胞比例有利于培養(yǎng)的細胞行使免疫殺傷的功能，并且能夠增強免疫反應。
　　(3)通過本文方法培養(yǎng)的細胞中能分泌大量的IFN-γ的細胞占較