胃癌基因組DNA拷貝數(shù)改變和miRNA表達譜研究.pdf

1、胃癌在全世界范圍內是處于發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，處于癌癥死因譜的第二位。在中國，胃癌的發(fā)病率高居各種惡性腫瘤之首，每年新確診患者達40萬，大約死亡26萬／年，占所有惡性腫瘤死亡的23.24％，同時仍然呈上升趨勢。由于胃癌患者經常處于晚期才被確診，因而其預后較差，五年生存率低于20%。導致胃癌發(fā)生的因素很多，包括胃幽門螺旋桿菌H．pylori感染，飲食，環(huán)境和遺傳岡素等。盡管對于胃癌的分子遺傳學研究已經開展多年，發(fā)現(xiàn)了一系列諸如TP53，

2、CDH1、APC、TGFBR2、FGF2、MET等胃癌相關的癌基因與抑癌基因，但是導致胃癌發(fā)生的分子遺傳學改變和機制仍然有待闡明。同時，由于胃癌的高度異質性，遺傳學改變的差異導致了患者個體在發(fā)病機理和臨床轉歸方而的差異性較大。比較基因組雜交(CGH or array-CGH)結果顯示胃癌患者基因組DNA拷貝數(shù)改變(copy number aberrations，CNAs)的不同模式與其臨床表現(xiàn)和預后存在明顯的相關性。因此，對胃癌進行基因

3、組水平的DNA拷貝數(shù)改變分析，不僅能夠對胃癌發(fā)生分子機制進行進一步的闡釋并提供具有臨床指導意義的腫瘤標記物，而且能夠為開發(fā)新一代的診斷參數(shù)提供依據(jù)，以在臨床實踐中更好地指導胃癌的分子分型和個體化治療。
　　 多重連接依賴探針擴增(Multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術是一種用于分析DNA拷貝數(shù)變化的新技術，可以通過很少量的基因組DNA(20-100ng)在單

4、一反應中同時檢測45個核酸序列的拷貝數(shù)變化。在本研究中，我們在全基因組范圍內選取了112個腫瘤相關基因位點作為MLPA的探針，在50例不同分期、分級和轉移程度的經顯微切割的腸型胃癌組織中利用MLPA技術進行了傘面的DNA拷貝數(shù)分析。
　　 我們發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)增加位點包括3p22、6p21、8q24和20q13，拷貝數(shù)減少位點包括1p36、9p21和17p13.1，這些結果與已發(fā)表的胃癌比較基因組雜交的研究結果具有高度的一致性，表明

5、MLPA技術是一種可靠而有效的分析胃癌組織基因組DNA拷貝數(shù)改變的方法。我們還發(fā)現(xiàn)，淋巴結轉移陰性樣本中的CNA位點數(shù)目明顯低于淋巴結轉移陽性樣本，統(tǒng)計學分析結果證實在腸型胃癌中CNA的位點數(shù)日與淋巴結轉移狀態(tài)呈正相關(P＜0.05)。另外，依據(jù)聚類分析和CNA數(shù)目分析的結果，我們將50例腸型胃癌樣本成功分成兩個亞型：帶有較多CNA的G1＋2亞型，和帶有較少CNA的G3＋4亞型。其中,3p22.1、4q25、11p13和12p13.32

6、位點的拷貝數(shù)增加，以及1p36、6p21.3、9p21.3、12p13.3和17p13.1位點的拷貝數(shù)減少在G1＋2亞型中很明顯，而高頻率的20q13.13位點的拷貝數(shù)增加則是G3＋4亞型的標志性事件。在兩種亞型之間，淋巴結轉移狀態(tài)具有顯著性差別(P=0.034)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胃癌中染色體4q25和11p13(EHF)位點的高水平擴增，并且本文第二部分的表達分析實驗結果顯示位于染色體4q25的miR-302c在胃癌組織中存在過表達。

7、最后，統(tǒng)計學分析還證實MDM2基因的拷貝數(shù)與胃癌TNM分期呈正相關(P＜0.05)，11p13(EHF)的擴增、9p21.3(CDKN2A)、11q13.3、17q25.3(TIMP2)和22q11.23(MIF)的缺失與胃癌的淋巴結轉移具有相關性(P＜0.05)。我們建立的這種以DNA拷貝數(shù)改變的幅度和頻率為基礎的胃癌分子分型標準，具有在臨床病理檢測中應用的潛力，可以作為輔助手術決策的指標之一。
　　 微小RNA(miRNAs

8、)是一種小分子非編碼RNA，通過抑制靶基因mRNA的翻譯或誘導mRNA的降解調節(jié)大約30%人類基因的表達。近年來，大量的研究表明miRNA在細胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化和代謝等過程中發(fā)揮了重要的作用。最近，miRNA的表達被證明與腫瘤的發(fā)牛發(fā)展有密切關系。如果一個miRNA在某種腫瘤中表達下調并且其靶基因是癌基因，那么這個miRNA就發(fā)揮抑癌基因的作用；同理，如果一個miRNA在某種腫瘤中表達上調并且其靶基因是抑癌基因或重要的控制分化基因

9、，那么它就發(fā)揮癌基因的作用。因此，通過對胃癌組織中miRNA表達譜的分析找到在胃癌中表達失調的miRNA，并進一步確定其靶基因及其參與的信號調節(jié)通路，將對闡明胃癌發(fā)生的分子機制具有重要的理論意義。而且，miRNA作為重要的生長調節(jié)和細胞周期調控因子，具有成為新一代腫瘤標記物的潛力，對于胃癌的早期診斷、分期和預后提示均有重要的臨床意義。
　　 在本文第二部分中，我們首先建立了將總RNA加ploy(A)尾后進行反轉錄PCR擴增特異m

10、iRNA，使用QuantityOne軟件對PCR產物電泳結果進行定量分析，計算每對胃癌樣本腫瘤與瘤旁組織比值(T/NRatio)的實驗平臺系統(tǒng)——Poly(A)-tailed semi-quantitative RT-PCR技術，并通過miR-16的成功擴增和測序確認，證明該系統(tǒng)能夠快速有效的分析miRNA的表達。進一步通過Pearson相關分析在2對樣本中發(fā)現(xiàn)miR-21表達量的實時定量PCR結果與Poly(A)-tailed sem

11、i-quantitative RT-PCR的結果高度一致（相關系數(shù)r約等于1），證明該實驗和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)具有較好的可靠性和準確性。在上述工作基礎上，我們使用該系統(tǒng)在8例胃癌及癌旁組織樣本中對237個miRNA進行了表達譜分析，161個miRNA在電泳中可見到明顯的產物條帶，而76個miRNA未檢測到擴增條帶。對于檢測到表達的161個miRNA，使用SAM軟件進行統(tǒng)計分析，確認22個在胃癌中表達上調，2個在胃癌中表達下調(FDR=0.09

12、63)。其中5個miRNA(miR-21、miR-223、miR-17-5p、miR-106a和miR-93)在胃癌組織中的過表達與同期發(fā)表的其他研究結果一致，而其余19個miRNA的表達差異均為首次報道。這些在胃癌中異常表達的miRNAs具有成為新一代胃癌標記物的潛力，能夠為胃癌的精確診斷分型提供依據(jù)，同時針對這些靶點可以開發(fā)新的核酸治療技術，通過抑制或增強其功能來達到治療胃癌的目的。
　　 我們進一步通過生長抑制試驗證實在胃

13、癌組織中表達異常增高的miR-21和miR-17-5p對胃癌細胞的生長有明顯的促進作用。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)位于人類染色體1p36區(qū)域的CHD5基因的3’-UTR區(qū)324-330位的7個核苷酸序列在物種間具有高度的保守性，且與miR-17-5p的5’端的2-8位核苷酸完美互補。通過熒光素酶報告基因實驗，我們確認了該位點即為miR-17-5p與CHD5 mRNA相互作用的結合位點，miR-17-5p通過調節(jié)CHD5基因的轉錄后調控（抑制