基于溫度敏感型材料的O-GlcNAc糖基化蛋白富集新方法研究.pdf

1、蛋白質的O-GlcNAc糖基化修飾過程，廣泛存在于生物組織、細胞內，并且具有與蛋白質的磷酸化修飾相似的性質及功能，在各種生命活動中都有舉足輕重的作用，如細胞識別、信號傳導、免疫應答、基因轉錄等。要想從整體水平上明確相關疾病的發(fā)展，就要開展對于O-GlcNAc修飾的規(guī)?；芯俊Ｈ欢壳癘-GlcNAc糖基化修飾的規(guī)?；b定面臨以下主要困難:(1)O-GlcNAc修飾含量極低;(2)質譜檢測時O-GlcNAc修飾肽段信號被大量的非修飾肽段抑

2、制;(3) O-GlcNAc修飾容易發(fā)生動態(tài)變化，在樣品制備時很容易從蛋白質上脫落;(4)O-GlcNAc修飾肽段親水性較強并且自身不帶電荷，因而導致質譜信號響應差并且在二級碎裂時極易產(chǎn)生中性丟失，難以獲得高質量的二級譜圖。因此，為了提高O-GlcNAc修飾在蛋白質鑒定中的規(guī)模，急需發(fā)展一系列O-GlcNAc糖基化修飾的高效、快速富集及檢測方式。這對于揭示蛋白糖基化在生理、病理過程中的重要作用都具有十分重要的意義。
　　N-異丙基

3、丙烯酰胺(N-Isopropyl acrylamide，NIPA)是目前為止性能最穩(wěn)定、使用最廣泛的溫度敏感型聚合物單體。當環(huán)境溫度較低，沒有到達最低共溶溫度(Lower CriticalSolution Temperature，LCST)時，聚合物在水溶液中以線性分子的分散狀態(tài)存在，溶液呈澄清透明狀態(tài);當環(huán)境溫度到達或高于相轉變溫度時，聚合物自發(fā)卷曲，疏水基團暴露在外側，從而逐漸從水溶液以沉淀形式析出，達到非均相的狀態(tài)。以該聚合物作為

4、富集基質，通過改變不同溫度條件，可以實現(xiàn)均相分散與異相沉淀的快速轉化，應用于低豐度蛋白/肽段的富集。采用該可溶性聚合物載體在均相體系中進行富集反應，可有效避免使用常規(guī)固相載體材料富集時較高的固-液界面?zhèn)髻|阻力，以及載體材料-目標分子間較大的空間位阻。在顯著提高富集速率、效率的同時又可利用溫敏聚合物在高溫下沉淀析出的特性，快速、高效地完成復雜樣品中目標產(chǎn)物的分離與回收。
　　論文第一章綜述了蛋白質組學發(fā)展現(xiàn)狀、糖基化蛋白質的研究以及

5、基于生物質譜技術對于O-GlcNAc糖蛋白的規(guī)?；b定;O-GlcNAc糖蛋白常用的富集方法主要有凝集素富集法、抗體富集法、代謝標簽富集法、化學酶促標記富集法、β-消除-邁克爾加成富集法、酰肼富集法等;溫度敏感型聚合物簡單介紹、常用條件以及施陶丁格反應的原理及應用。
　　論文第二章制備了施陶丁格試劑修飾的瓊脂糖凝膠，并基于施陶丁格基團與疊氮的特異性反應，將其應用于疊氮標記的標準O-GlcNAc修飾蛋白的富集研究。實驗首先優(yōu)化了材料

6、制備時施陶丁格基團的固載量及富集材料的使用量，并進一步通過對牛血清白蛋白與疊氮標記的標準O-GlcNAc修飾蛋白混合物的富集，考察了該材料富集的選擇性與特異性。結果顯示該材料可以特異性富集疊氮標記的O-GlcNAc修飾蛋白。
　　論文第三章研究了溫度敏感型線性聚合物的制備及其在蛋白質分離富集中的應用。在引發(fā)劑過硫酸鉀(Potassium persulfate)的引發(fā)下，N-異丙基丙烯酰胺與丙烯酸甲酯(Methyl Acrylate

7、)發(fā)生自由基聚合反應，生成含有酯基的線性共聚物;再利用水合肼將含有酯基的聚合物酰肼化，從而在聚合物側鏈末端共價修飾酰肼基團，得到的酰肼化的溫敏聚合物繼續(xù)與2-（二苯基膦）對苯二甲酸1-甲基4-五氟苯基二酯(2-(Diphenylphosphino)terephthalic acid1-methyl4-pentafluorophenyl diester,phosphine-PFP ester)發(fā)生反應，合成出側鏈修飾有大量施陶丁格基團的溫