FXR對apoM表達的影響及其機制的初步探討.pdf

1、研究背景:
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病。體內脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關。類法尼醇X受體(famesoid X receptor,FXR)是孤兒核受體(orphan nuclear receptor)家族成員,是內源性膽汁酸(bile acids)的感應器(sensor),鵝脫氧膽汁酸(chenodexycholic acid,CDCA)為其最適天然配

2、體。FXR通過調節(jié)諸多靶基因而調控脂類、膽固醇和葡萄糖的代謝,其在維持脂代謝平衡、膽汁酸代謝過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。FXR與AS的發(fā)生密切相關。
　　 載脂蛋白(apolipoproteinM,apoM)是一種新近發(fā)現的載脂蛋白,它含有一個特征性的疏水結合盒。成熟的apoM保留了具有“疏水錨”作用的信號肽。研究發(fā)現apoM可能通過此信號肽錨著在高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)磷脂單層中,

3、并且在HDL中含量極為豐富。研究結果表明apoM可通過影響膽固醇的逆向轉運過程參與HDL的代謝過程,進而發(fā)揮重要的抗AS的功能。
　　 由于FXR和apoM均高表達于肝臟,且二者均與AS密切相關。那么apoM是否受FXR的調節(jié)?弄清該問題,對進一步闡明二者在AS發(fā)生發(fā)展中的作用,為防治AS的新靶點提供新的科學依據。
　　 研究目的:探討FXR對apoM表達的影響及其調控的可能機制。
　　 研究方法:
　　

4、 (1)選取肝癌細胞株HepG2和胎肝細胞株L02為細胞模型,經FXR激動劑(CDCA)處理細胞24h后,用RT-PCR法檢測apoM表達的變化;經FXR激動劑(CDCA)處理細胞12h后,再用FXR的抑制劑(Guggulsterones)處理細胞24h,RT-PCR法檢測apoM表達的變化。
　　 (2)選取肝癌細胞株HepG2為細胞模型,Western blotting免疫印跡法檢測apoM蛋白表達的差異。
　　 (

5、3)選取C57BL/6小鼠為動物模型,喂食CDCA后,RT-PCR法檢測小鼠肝臟組織apoM mRNA表達的變化,Western blotting免疫印跡法檢測小鼠肝臟組織apoM蛋白表達的差異。同時用免疫組化法檢測小鼠肝、腎組織的表達。用勻相測定法檢測小鼠血脂的變化。
　　 (4)通過生物信息學分析,在線預測人apoM基因5'側翼啟動子區(qū)域AGGTCAggAGTTCA存在FXR可能結合位點(DR2):提取HepG2細胞基因組D

6、NA,PCR法擴增人apoM報告基因,構建重組質粒PGL3-basic/apoM(-1900～+165含DR2序列)和PGL3-basic/apoM(-1800～+165不含DR2序列)。脂質體法將vpFXR真核表達質粒瞬時共轉染HepG2細胞,通過熒光素酶報告基因檢測FXR對apoM啟動子活性影響。
　　 研究結果:
　　 (1)在FXR激動劑(CDCA)處理的人肝癌細胞HepG2和胎肝細胞L02中,發(fā)現FXR顯著下調

7、apoM的表達(p＜0.05)。
　　 (2)在FXR活化后再用抑制劑(Guggulsterones)處理的人肝癌細胞HepG2和胎肝細胞L02中,發(fā)現FXR顯著上調apoM的表達(p＜0.05)。
　　 (3)C57BL/6小鼠喂食含CDCA的食物,FXR活化后在體內可下調小鼠肝臟apoM的表達。
　　 (4)小鼠免疫組化結果顯示:隨著CDCA濃度的增加,小鼠肝臟和腎臟apoM的表達下降。
　　 (5)

8、小鼠血脂測定結果顯示:HDL和TC隨CDCA濃度的升高而下降,LDL隨CDCA濃度升高而升高,TG隨著CDCA濃度的升高先升高再下降。
　　 (6)根據生物信息學分析人apoM基因轉錄起始位點上游3000bp區(qū)域,得出在-1863bp處存在可能FXR結合位點(DR2)。通過共轉染實驗結果顯示:FXR可降低人apoM(-1900～+165)含有DR2序列啟動子片段的轉錄活性,且下調幅度為對照的40％。而FXR對不含有DR2序列的人

9、apoM(-1800～+165)啟動子片段活性無影響。
　　 結論:
　　 (1)用FXR激動劑(CDCA)處理細胞后,發(fā)現FXR顯著下調apoM的表達(p＜0.05)。
　　 (2)用FXR抑制劑(Guggulsterones)處理細胞后,發(fā)現FXR顯著上調apoM的表達(p＜0.05)。
　　 (3)FXR活化后可下調小鼠體內apoM的表達。
　　 (4)通過共轉染實驗結果得出:FXR可能通過