凋亡抑制蛋白c-FLIP促進肝癌細胞葡萄糖代謝機制的研究.pdf

1、肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，肝癌引起的死亡人數(shù)占到了世界癌癥死亡人口的三分之一，是我國第二大癌癥死亡原因。目前，我國肝癌發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升趨勢，帶來沉重的社會、醫(yī)療和家庭負擔(dān)。肝癌目前主要的治療方式有手術(shù)切除，肝移植，介入治療，以及放化療。由于近年分子靶向藥物在肝癌中的應(yīng)用，肝癌患者的預(yù)后有了一定程度的改善，但仍需要尋找更有效的肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵靶點分子。由于肝癌惡性程度高，進展迅速，往往發(fā)現(xiàn)較晚，造成腫瘤死亡率很高，在肝癌中

2、通過對肝癌發(fā)生發(fā)展過程中分子調(diào)控機制的研究，找到特異性的肝癌治療位點，并針對該治療位點開發(fā)肝癌藥物，在肝癌治療中具有重要的意義。
　　凋亡抑制蛋白c-FLIP（cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β-converting enzyme inhibitory protein）是1997報道發(fā)現(xiàn)的IAP家族中的一個重要成員，是一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制蛋白

3、，在病毒、真核生物、哺乳動物等許多物種中廣泛存在，與炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細胞中，c-FLIP在細胞外凋亡通路，NF-κB通路，以及自噬和壞死通路中發(fā)揮重要的功能，有證據(jù)顯示，c-FLIP對很多蛋白泛素化過程具有調(diào)節(jié)作用。c-FLIP是在肝癌細胞中促進腫瘤的增殖，在肝癌組織的中的表達較癌旁組織中高，與肝癌的預(yù)后具有負相關(guān)性。腫瘤的惡性增殖離不開能量物質(zhì)的供給和代謝失常，c-FLIP與肝癌細胞能量代謝是否相

4、關(guān)，目前還未見報道。
　　葡萄糖作為細胞的主要能源物質(zhì)，在腫瘤增殖過程中發(fā)揮重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的葡萄糖代謝與正常組織的葡萄糖代謝是不同的。在腫瘤細胞中，葡萄糖主要通過有氧酵解的方式進行代謝，產(chǎn)生大量的乳酸。在腫瘤細胞中，葡萄糖的攝取明顯高于正常組織，腫瘤細胞通過過表達葡萄糖轉(zhuǎn)運體來滿足自身的葡萄糖需求。在不同的腫瘤細胞，表達不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運體。腫瘤葡萄糖代謝的改變主要依賴于細胞中各種癌基因和抑癌基因的共同作用來實現(xiàn)的。

5、
　　c-FLIP在肝癌中作為一種促進腫瘤增殖的分子，是否對腫瘤的葡萄糖代謝具有影響呢？影響機制是什么？本課題針對上述問題進行了深入的探討和研究。
　　目的:
　　明確c-FLIP對肝癌細胞葡萄糖代謝是否具有影響；闡明c-FLIP調(diào)控細胞葡萄糖代謝的機制；分析c-FLIP調(diào)控肝癌細胞葡萄糖代謝在肝癌發(fā)生發(fā)展中意義，以及與肝癌的臨床預(yù)后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.將c-FLIPL干涉慢病毒感染細胞，構(gòu)建c

6、-FLIPL特異性干涉的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞；用能量實時檢測儀seahorse XF24 Analyer分析c-FLIPL對肝癌細胞葡萄糖代謝的影響；在細胞培養(yǎng)基中使用熒光標(biāo)記的葡萄糖類似物2-NBDG，流式細胞儀分析細胞葡萄糖攝取能力，構(gòu)建小鼠肝癌荷瘤模型，并利用小動物PET-CT分析機體腫瘤葡萄糖攝取能力，同時在肝癌荷瘤模型中分析c-FLIPL對肝癌增殖的影響。
　　2.通過Western Blot和RT-PCR在蛋白和RNA水平分析c-

7、FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運體的影響；通過蛋白質(zhì)泛素化檢測方法檢測c-FLIPL對葡萄糖轉(zhuǎn)運體泛素化降解影響；使用免疫共沉淀和間接免疫熒光實驗檢測蛋白質(zhì)間的相互作用。
　　3.流式細胞儀檢測肝癌細胞在低糖條件下細胞的凋亡水平；篩選出對低糖敏感的肝癌細胞系；分析c-FLIPL對低糖耐受的影響。
　　4.利用免疫組化技術(shù)測定肝癌及癌旁組織中c-FLIPL及其調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達；分析在肝癌中和癌旁組織中的表達是否具有差異，二者之間

8、的表達是否具有相關(guān)性；統(tǒng)計分析其表達與肝癌臨床分期的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.c-FLIPL促進肝癌細胞糖酵解，同時在細胞水平和動物模型中發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過促進細胞葡萄糖的攝取進而促進肝癌細胞有氧酵解。我們還發(fā)現(xiàn)，在肝癌荷瘤裸鼠動物模型中，c-FLIPL促進腫瘤的增殖。
　　2.在肝癌細胞中，我們發(fā)現(xiàn)c-FLIPL影響細胞葡萄糖攝取是通過與SGLT1相互作用，抑制肝癌細胞中SGLT1蛋白泛素化，抑制SGLT1降

9、解，促進肝癌細胞通過SGLT1主動攝取葡萄糖。
　　3.不同的肝癌細胞系對低糖的敏感性不同，在肝癌細胞系HepG2,MHC-97h,Huh-7，SMMC-7721,BEL-7704中，HepG2,MHC-97h,Huh-7對低糖耐受,SMMC-7721,BEL-7704對低糖敏感，在對低糖耐受的細胞中，SGLT1的表達較敏感細胞表達高。提示SGLT1對細胞低糖耐受起重要的作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過影響SGLT1促進細胞

10、對低糖的耐受。
　　4.我們通過免疫組化檢測c-FLIPL和SGLT1在肝癌組織和癌旁組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)c-FLIPL和SGLT1在在肝癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)c-FLIPL的表達與SGLT1的表達具有正相關(guān)性。同時發(fā)現(xiàn)，在肝癌中c-FLIPL和SGLT1的表達與肝癌的臨床分期具有正相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　本課題研究發(fā)現(xiàn)c-FLIPL通過抑制肝癌細胞葡萄糖主動轉(zhuǎn)運體SGLT1的降解，促進細胞