MiR-9在膠質瘤惡性行為中的作用及其機制的研究.pdf

1、【背景】
　　膠質瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤。根據膠質瘤組織病理學特點和臨床標準,世界衛(wèi)生組織(WHO)將其分為I-IV級。I級膠質瘤在兒童多發(fā),且一般認為 I級膠質瘤為良性腫瘤,可通過手術切除治愈,很少發(fā)生惡性進展;相比之下II、III級膠質瘤具有一定侵襲性且惡性程度更高,預后較差;惡性程度最高且預后最差的是IV級膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM),根據其是否由低級別膠質瘤進展而來,可

2、將其分為原發(fā)性膠質母細胞瘤和繼發(fā)性膠質母細胞瘤。
　　MicroRNAs(miRNA)為普遍存在于動植物體內的內源性小片段非編碼RNA分子,可通過與多個靶基因信使RNA(mRNA)結合從而調控基因的表達。miRNAs在進化中高度保守性,提示其可能在生命功能的諸多方面發(fā)揮重要作用。與腫瘤相關的miRNAs可根據其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調節(jié)作用,分為促癌miRNAs和抑癌miRNAs。目前的研究主要集中于挖掘與正常組織或細胞系相比,腫瘤中m

3、iRNAs的差異表達,進而研究其功能及尋找下游調控靶基因。已有大量研究表明miRNAs在包括膠質瘤在內的腫瘤中發(fā)生差異表達,這些miRNAs在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。
　　MiR-9在動植物中高度保守,且已被證實在多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而,其在膠質瘤中的功能卻不明確。MiR-9在膠質瘤中的表達有何特點?其異常表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有何影響?MiR-9又是通過調節(jié)哪些重要靶基因來影響膠質瘤的進展過程?在膠質瘤

4、中miR-9異常表達的機制是什么?上述問題的研究將有助于探索膠質瘤的惡性行為機制,探究將miR-9作為治療靶點的可行性,為膠質瘤的臨床治療提供了新策略。
　　【目的】
　　探究膠質瘤臨床樣本及其膠質瘤細胞系中miR-9的表達情況;研究miR-9在膠質瘤惡性進展中的生物學作用;尋找及鑒定 miR-9調節(jié)的功能相關靶基因;尋找調控 miR-9的轉錄因子和表觀遺傳學調節(jié)因素,為膠質瘤的預防、早期診斷以及治療靶點選擇提供新的理論依據

5、。
　　【方法】
　　1.通過qRT-PCR檢測臨床組織樣本和膠質瘤細胞系中 miR-9的表達水平;2.體外 A172細胞轉染 miR-9 mimic和U251細胞轉染 miR-9 inhibitor分別上調和下調miR-9的表達,通過MTT實驗、流式細胞術、劃痕實驗、Transwell實驗、血管生成實驗和粘附實驗分析miR-9對膠質瘤細胞多種生物學行為的影響;3、運用生物信息學分析軟件預測miR-9潛在的功能靶基因,分子克

6、隆技術將預測靶基因3’UTR結合區(qū)域連接至PGL3報告基因質粒;4、利用熒光素酶報告基因實驗鑒定miR-9直接調控靶基因,并用qRT-PCR、Western blot和ELISA實驗在mRNA和蛋白水平上進行驗證;5、利用生物信息學網站預測對miR-9調節(jié)的轉錄因子及H3K27組蛋白甲基化,qRT-PCR檢測轉錄因子與H3K27組蛋白甲基化狀態(tài);6.采用siRNA干擾技術和瞬時轉染過表達質粒下調/上調轉錄因子和組蛋白去甲基化酶,分析mi

7、R-9的表達情況。
　　【結果】
　　1.qRT-PCR分析結果顯示,與正常腦組織相比,在膠質瘤組織樣本中 miR-9的表達水平增高;與正常膠質細胞HEB相比,miR-9在膠質瘤細胞系中均高表達,其中在膠質瘤細胞A172中相對表達較低,在U251細胞系中表達較高;與正常腸上皮細胞相比,miR-9在結直腸癌中表達較高;而與正常腎上皮細胞相比,在腎癌中miR-9呈現低表達,表明miR-9的表達具有組織特異性;2.A172細胞轉染

8、mimic后可有效上調miR-9的表達水平,MTT結果顯示miR-9促進膠質瘤細胞增殖能力,細胞周期分析過表達miR-9組細胞進入S期細胞增多,G1期細胞數減少;上調miR-9表達后,A172膠質瘤細胞遷移和侵襲細胞數明顯增高,過表達miR-9組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)內皮細胞HUVEC,增強了HUVEC細胞體外成管能力;而同時對U251細胞系轉染inhibitor后,細胞增殖能力下降、細胞周期S期細胞數量顯著減少,G1期細胞增多,Transwe

9、ll結果可見下調miR-9組穿過小室細胞數量明顯減少,條件培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVEC細胞,成管能力顯著減弱;3.外源轉染miR-9 mimic可顯著提高HUVEC細胞miR-9的表達水平,Transwell結果顯示過表達miR-9組較多細胞穿至小室膜下,過表達miR-9 HUVEC細胞成管數量相比NC組顯著增多;且miR-9組內皮細胞粘附力增強;4.生物信息學預測提示,THBS2、COL18A1、PTCH1和PHD3可能為潛在miR-9的下游

10、靶基因,從而影響膠質瘤增殖能力、遷移和侵襲、血管生成等生物學行為;5.qRT-PCR、Western blot、ELISA和熒光素酶報告基因實驗進一步證實THBS2、COL18A1、PTCH1和PHD3確實為miR-9直接調控的下游靶基因;6、膠質瘤細胞A172中過表達C-MYC后,qRT-PCR分析發(fā)現miR-9表達增高;在U251細胞中應用siRNA技術下調C-MYC后,miR-9表達下調,且均主要影響miR-9-2的表達;7、在膠

11、質瘤細胞A172中瞬時上調OCT4的表達,qRT-PCR結果顯示miR-9表達上調,而且siRNA干擾U251細胞中OCT4的表達,miR-9表達下調,但是主要調節(jié)miR-9-1/3的表達;8.在膠質瘤細胞A172中過表達組蛋白去甲基化酶KDM6A/B,qRT-PCR結果顯示miR-9的表達增高,而在U251中干擾KDM6A/B表達則miR-9表達呈現降低,均主要調節(jié)miR-9-2的表達。
　　【結論】
　　1.MiR-9在