熱休克蛋白70在苯并(a)芘所致DNA損傷修復中的作用和交互作用蛋白分析.pdf

1、HSPs是生物界(包括從細菌到人類)經(jīng)過長期進化仍保留下來的、對體內外不良因素起保護作用的一類蛋白質。根據(jù)HSPs在SDS-PAGE上的結果，按其分子量大小將HSPs分為如下幾個家族：大分子HSPs(≥100 KD)，HSP90(81 - 99 KD)，HSP70(65 - 80 KD)，HSP60(55 - 64 KD)，HSP40(35 - 54 KD)，小分子HSPs(≤34 KD)，其中最為主要和重要的是HSP70家族的Hsp7

2、0。許多研究提示了其可能的作用和功能如下：1) Hsp70保護細胞或生物免遭各種應激因素的損害，賦予它們從各種應激中恢復的能力；其中，表現(xiàn)最為明顯的是熱耐受能力的形成，即當細胞或生物接觸亞致死溫度后，表現(xiàn)對致死溫度的存活率明顯增加，并且對其他性質的致死性應激的抵抗能力也可能增強；2) Hsp70對細胞內重要遺傳物質DNA可能具有重要保護作用，且在生物生長、發(fā)育和分化過程中也起著重要作用；3) Hsp70與體內許多重要生物活性物質(如類固

3、醇、腫瘤壞死因子等)有著密切的聯(lián)系，參與體內許多調節(jié)過程；4)更重要的是，Hsp70作為分子伴侶，促進蛋白質的合成、折疊、裝配和運輸，還參與變性蛋白質的清除，這種重要功能可能與熱耐受、毒物耐受有關。 本研究通過構建高表達和低表達Hsp70兩種細胞模型，用BaP處理細胞，利用彗星實驗、宿主細胞再活化實驗來觀察Hsp70表達水平不同細胞中修復能力的差異，同時用免疫共沉淀和高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質譜檢測在DNA修復過程中和Hsp7

4、0結合存在的各種蛋白，從中篩選出可能的Hsp70作用底物。并對篩選出來的Hsp70交互作用蛋白利用免疫共沉淀、激光共聚焦和放射性自顯影進行進一步的確證，為闡述Hsp70在BaP染毒修復過程中的作用機制提供科學依據(jù)。本研究共分四部分。 第一部分、高和低表達Hsp70細胞模型的建立 對于Hsp70高表達細胞模型的建立，我們通過轉染16HBE細胞pcDNA3.1/pcDNA3.1-hsp70重組質粒，并用G418篩選穩(wěn)定的Hs

5、p70高表達細胞株(16HBE/hsp70)。用轉染空載體質粒pcDNA3.1的16HBE細胞作為轉染對照(16HBE /pcDNA)。 對于Hsp70低表達細胞模型的建立我們采用了槲皮素抑制Hsp70表達和RNA干擾技術兩種方法，通過對Hsp70的表達水平的驗證對進行兩種方法的效果進行比較。 RNA干擾（RNAi）是近年來發(fā)展起來的一種研究基因功能的新方法。RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源

6、mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展，被《Science》雜志評為2001年的十大科學進展之一，并名列2002年十大科學進展之首。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術已被廣泛用于探索基因的功能。運用這項技術時，可以通過轉染編碼shRNA的質粒、小干擾RNA等達到特異性降低目的基因的目的。在本研究中，采用轉染質粒的方法，在瞬時轉染48小時后，對Hsp70的表達進行檢測，從而對沉默效果

7、進行評估。 最后我們對高表達和低表達Hsp70的細胞模型進行了鑒定。利用細胞免疫熒光技術和Western-blot技術檢測各組細胞中Hsp70的表達。細胞免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)RNAi組細胞（16HBE/RNAi）的熒光強度明顯低于正常培養(yǎng)的16HBE組細胞，而高表達Hsp70組（16HBE/hsp70）細胞的胞漿內熒光強度明顯高于正常培養(yǎng)的16HBE組細胞；Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與16HBE組相比，16HBE /RNAi

8、組Hsp70表達降低了42％(P﹤0.01)，16HBE /hsp70組 Hsp70表達增加了78％(P﹤0.01)。16HBE /DMSO、16HBE/HK和16HBE /pcDNA組Hsp70的表達未見明顯變化(P>0.05)。槲皮素濃度為100μM時，對Hsp70的表達抑制了53％，稍高于沉默組，但是由于槲皮素對Hsp70的抑制是非特異性的，因而采用RNA干擾技術進行后續(xù)的相關研究。 第二部分、Hsp70在B(a)P、BP

9、DE所致DNA損傷修復中的作用 為比較B(a)P染毒后，不同Hsp70表達水平的16HBE細胞DNA修復能力的差異，本部分首先用彗星試驗檢測16μM BaP染毒16HBE細胞2h，恢復不同時間(0，2，4，8，24h)，Hsp70表達水平不同的細胞對DNA損傷的修復差異。所設八組細胞Control、16HBE/HK、16HBE /RNAi、16HBE /hsp70、16HBE/pcDNA、DMSO、S9、NC(normal cul

10、tured)在處理后存活率均大于80％，并且在DMSO、S9和NC組中，存活率大于90％，均符合毒理學要求。彗星實驗結果表明隨著恢復時間的延長，各組細胞OTMs均下降，說明殘留DNA損傷的減少。在恢復前2h內，降低迅速，提示這個時間段為修復最活躍階段。在2h到8h，速度減慢。24h后，OTMs基本達到正常水平（NC，normal cultured，顯示正常培養(yǎng)時的OTMs），提示修復過程基本完成。高表達Hsp70組在修復最活躍的前2h相

11、對于對照組，OTMs值降低更迅速，說明高表達Hsp70組修復進行得更快。并且在恢復的各個時間點，高表達Hsp70組殘留的OTMs值均小于對照組，且差異有極顯著性（P<0.01）。而在低表達Hsp70組中，在修復最活躍的前2h內OTMs的降低速度和對照組相比明顯減慢（P<0.01）。由此可見，在修復最活躍的前2h的結果提示，Hsp70參與了BaP造成的DNA損傷的修復過程，它可以促進細胞對這種損傷的修復。這可能與作為分子伴侶的Hsp70可

12、以幫助變性受損的蛋白質復性或降解有關，高表達的Hsp70增強了分子伴侶作用，保持了蛋白質的穩(wěn)態(tài)，減輕了細胞的損傷。 第三部分、BaP作用下Hsp70交互作用蛋白的鑒定 在本部分中，16μM B(a)P染毒16HBE細胞2h恢復4h后，運用免疫共沉淀把在修復過程中和Hsp70有交互作用的所有蛋白沉淀下來，并對其進行高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質譜分析（HPLC ESI MS/MS）。樣本中總共有730種蛋白被檢測，我們對其中含量

13、較高的84種蛋白進行了分析，根據(jù)swiss-prot database蛋白質數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org)提供了蛋白質的各種說明，包括蛋白名稱、起源、功能、交互作用、結果等，把這84種蛋白分成了13個功能組，分別是細胞結構和移動（14％）、蛋白質代謝和修飾（12％）、DNA穩(wěn)定性（6％）、細胞內和細胞間信號（7％）、細胞分化和增殖（74％）、蛋白交互作用（6％）、凋亡（5％）、核酸代謝（5％）、生理功能的執(zhí)行（6％

14、），細胞損傷保護（2％）、能量代謝（1％），未知部分和其他部分（27％）。從結果可見，在修復過程中，Hsp70不僅和參與生理功能的蛋白質有交互作用，而且和維持DNA穩(wěn)定、抵抗細胞損傷的蛋白質之間也有交互作用，Hsp70可能是通過復雜的功能網(wǎng)絡參與BaP所致?lián)p傷的修復，這為進一步闡述Hsp70在修復過程中所發(fā)揮的多重功能提供了線索。 第四部分、BaP作用下Hsp70和CKII的交互作用 Hsp70和CKII免疫共沉淀結果顯

15、示，在兔抗人Hsp70抗體沉淀下來的復合物中，有CKII的存在。逆向免疫共沉淀即在羊抗人CKII抗體沉淀下來的復合物中也檢測到了Hsp70的存在。在16HBE細胞BaP染毒和不染毒時，我們得到了相同的結果。考慮到DNA修復是發(fā)生在細胞核內的，我們進一步用激光共聚焦技術來檢測這兩種蛋白質的位置關系，結果發(fā)現(xiàn)Hsp70和CKII在不染毒時主要分布在細胞漿，兩者大部分重合。在BaP染毒后這兩種蛋白均有一部分進入了細胞核，并且在某些位置明顯重合

16、。而測定不同Hsp70表達水平的細胞中的CKII活性結果顯示高表達Hsp70細胞CKII活性比對照組增高（P<0.05）而低表達Hsp70細胞中CKII活性則降低。 綜上所述，本研究的結果如下： (1)確定了100μM的槲皮素為抑制16HBE細胞Hsp70表達的最佳劑量，采用含hsp70基因的cDNA重組質粒進行細胞轉染并經(jīng)篩選建立了穩(wěn)定的Hsp70高表達細胞株。 (2)Hsp70可以增強BaP、BPDE所致DNA損

17、傷的修復。 (3)在B(a)P染毒恢復階段，Hsp70與維持DNA穩(wěn)定、細胞結構和移動等多種功能的蛋白質結合存在。 (4)Hsp70和修復密切相關的蛋白CKII在未染毒時在胞漿結合，染毒后均進入胞核并結合存在，并且高表達的Hsp70可以增強CKII的活性。 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)同時使用了高表達和低表達Hsp70的細胞模型，為探討Hsp70的功能提供有力的依據(jù)，可以從正反兩個方面同時驗證Hsp70的功能；(2)