熱休克蛋白70在苯并(a)芘所致DNA損傷修復(fù)中的作用和交互作用蛋白分析.pdf

1、HSPs是生物界(包括從細(xì)菌到人類)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化仍保留下來(lái)的、對(duì)體內(nèi)外不良因素起保護(hù)作用的一類蛋白質(zhì)。根據(jù)HSPs在SDS-PAGE上的結(jié)果，按其分子量大小將HSPs分為如下幾個(gè)家族：大分子HSPs(≥100 KD)，HSP90(81 - 99 KD)，HSP70(65 - 80 KD)，HSP60(55 - 64 KD)，HSP40(35 - 54 KD)，小分子HSPs(≤34 KD)，其中最為主要和重要的是HSP70家族的Hsp7

2、0。許多研究提示了其可能的作用和功能如下：1) Hsp70保護(hù)細(xì)胞或生物免遭各種應(yīng)激因素的損害，賦予它們從各種應(yīng)激中恢復(fù)的能力；其中，表現(xiàn)最為明顯的是熱耐受能力的形成，即當(dāng)細(xì)胞或生物接觸亞致死溫度后，表現(xiàn)對(duì)致死溫度的存活率明顯增加，并且對(duì)其他性質(zhì)的致死性應(yīng)激的抵抗能力也可能增強(qiáng)；2) Hsp70對(duì)細(xì)胞內(nèi)重要遺傳物質(zhì)DNA可能具有重要保護(hù)作用，且在生物生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過(guò)程中也起著重要作用；3) Hsp70與體內(nèi)許多重要生物活性物質(zhì)(如類固

3、醇、腫瘤壞死因子等)有著密切的聯(lián)系，參與體內(nèi)許多調(diào)節(jié)過(guò)程；4)更重要的是，Hsp70作為分子伴侶，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配和運(yùn)輸，還參與變性蛋白質(zhì)的清除，這種重要功能可能與熱耐受、毒物耐受有關(guān)。 本研究通過(guò)構(gòu)建高表達(dá)和低表達(dá)Hsp70兩種細(xì)胞模型，用BaP處理細(xì)胞，利用彗星實(shí)驗(yàn)、宿主細(xì)胞再活化實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察Hsp70表達(dá)水平不同細(xì)胞中修復(fù)能力的差異，同時(shí)用免疫共沉淀和高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)在DNA修復(fù)過(guò)程中和Hsp7

4、0結(jié)合存在的各種蛋白，從中篩選出可能的Hsp70作用底物。并對(duì)篩選出來(lái)的Hsp70交互作用蛋白利用免疫共沉淀、激光共聚焦和放射性自顯影進(jìn)行進(jìn)一步的確證，為闡述Hsp70在BaP染毒修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。本研究共分四部分。 第一部分、高和低表達(dá)Hsp70細(xì)胞模型的建立 對(duì)于Hsp70高表達(dá)細(xì)胞模型的建立，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞pcDNA3.1/pcDNA3.1-hsp70重組質(zhì)粒，并用G418篩選穩(wěn)定的Hs

5、p70高表達(dá)細(xì)胞株(16HBE/hsp70)。用轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pcDNA3.1的16HBE細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)照(16HBE /pcDNA)。 對(duì)于Hsp70低表達(dá)細(xì)胞模型的建立我們采用了槲皮素抑制Hsp70表達(dá)和RNA干擾技術(shù)兩種方法，通過(guò)對(duì)Hsp70的表達(dá)水平的驗(yàn)證對(duì)進(jìn)行兩種方法的效果進(jìn)行比較。 RNA干擾（RNAi）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種研究基因功能的新方法。RNA干擾是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源

6、mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來(lái)RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，被《Science》雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因的功能。運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)時(shí)，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染編碼shRNA的質(zhì)粒、小干擾RNA等達(dá)到特異性降低目的基因的目的。在本研究中，采用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對(duì)Hsp70的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)沉默效果

7、進(jìn)行評(píng)估。 最后我們對(duì)高表達(dá)和低表達(dá)Hsp70的細(xì)胞模型進(jìn)行了鑒定。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western-blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中Hsp70的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNAi組細(xì)胞（16HBE/RNAi）的熒光強(qiáng)度明顯低于正常培養(yǎng)的16HBE組細(xì)胞，而高表達(dá)Hsp70組（16HBE/hsp70）細(xì)胞的胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于正常培養(yǎng)的16HBE組細(xì)胞；Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與16HBE組相比，16HBE /RNAi

8、組Hsp70表達(dá)降低了42％(P﹤0.01)，16HBE /hsp70組 Hsp70表達(dá)增加了78％(P﹤0.01)。16HBE /DMSO、16HBE/HK和16HBE /pcDNA組Hsp70的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。槲皮素濃度為100μM時(shí)，對(duì)Hsp70的表達(dá)抑制了53％，稍高于沉默組，但是由于槲皮素對(duì)Hsp70的抑制是非特異性的，因而采用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)研究。 第二部分、Hsp70在B(a)P、BP

9、DE所致DNA損傷修復(fù)中的作用 為比較B(a)P染毒后，不同Hsp70表達(dá)水平的16HBE細(xì)胞DNA修復(fù)能力的差異，本部分首先用彗星試驗(yàn)檢測(cè)16μM BaP染毒16HBE細(xì)胞2h，恢復(fù)不同時(shí)間(0，2，4，8，24h)，Hsp70表達(dá)水平不同的細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)差異。所設(shè)八組細(xì)胞Control、16HBE/HK、16HBE /RNAi、16HBE /hsp70、16HBE/pcDNA、DMSO、S9、NC(normal cul

10、tured)在處理后存活率均大于80％，并且在DMSO、S9和NC組中，存活率大于90％，均符合毒理學(xué)要求。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞OTMs均下降，說(shuō)明殘留DNA損傷的減少。在恢復(fù)前2h內(nèi)，降低迅速，提示這個(gè)時(shí)間段為修復(fù)最活躍階段。在2h到8h，速度減慢。24h后，OTMs基本達(dá)到正常水平（NC，normal cultured，顯示正常培養(yǎng)時(shí)的OTMs），提示修復(fù)過(guò)程基本完成。高表達(dá)Hsp70組在修復(fù)最活躍的前2h相

11、對(duì)于對(duì)照組，OTMs值降低更迅速，說(shuō)明高表達(dá)Hsp70組修復(fù)進(jìn)行得更快。并且在恢復(fù)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高表達(dá)Hsp70組殘留的OTMs值均小于對(duì)照組，且差異有極顯著性（P<0.01）。而在低表達(dá)Hsp70組中，在修復(fù)最活躍的前2h內(nèi)OTMs的降低速度和對(duì)照組相比明顯減慢（P<0.01）。由此可見(jiàn)，在修復(fù)最活躍的前2h的結(jié)果提示，Hsp70參與了BaP造成的DNA損傷的修復(fù)過(guò)程，它可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)這種損傷的修復(fù)。這可能與作為分子伴侶的Hsp70可

12、以幫助變性受損的蛋白質(zhì)復(fù)性或降解有關(guān)，高表達(dá)的Hsp70增強(qiáng)了分子伴侶作用，保持了蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，減輕了細(xì)胞的損傷。 第三部分、BaP作用下Hsp70交互作用蛋白的鑒定 在本部分中，16μM B(a)P染毒16HBE細(xì)胞2h恢復(fù)4h后，運(yùn)用免疫共沉淀把在修復(fù)過(guò)程中和Hsp70有交互作用的所有蛋白沉淀下來(lái)，并對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析（HPLC ESI MS/MS）。樣本中總共有730種蛋白被檢測(cè)，我們對(duì)其中含量

13、較高的84種蛋白進(jìn)行了分析，根據(jù)swiss-prot database蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.expasy.org)提供了蛋白質(zhì)的各種說(shuō)明，包括蛋白名稱、起源、功能、交互作用、結(jié)果等，把這84種蛋白分成了13個(gè)功能組，分別是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和移動(dòng)（14％）、蛋白質(zhì)代謝和修飾（12％）、DNA穩(wěn)定性（6％）、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)（7％）、細(xì)胞分化和增殖（74％）、蛋白交互作用（6％）、凋亡（5％）、核酸代謝（5％）、生理功能的執(zhí)行（6％

14、），細(xì)胞損傷保護(hù)（2％）、能量代謝（1％），未知部分和其他部分（27％）。從結(jié)果可見(jiàn)，在修復(fù)過(guò)程中，Hsp70不僅和參與生理功能的蛋白質(zhì)有交互作用，而且和維持DNA穩(wěn)定、抵抗細(xì)胞損傷的蛋白質(zhì)之間也有交互作用，Hsp70可能是通過(guò)復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)參與BaP所致?lián)p傷的修復(fù)，這為進(jìn)一步闡述Hsp70在修復(fù)過(guò)程中所發(fā)揮的多重功能提供了線索。 第四部分、BaP作用下Hsp70和CKII的交互作用 Hsp70和CKII免疫共沉淀結(jié)果顯

15、示，在兔抗人Hsp70抗體沉淀下來(lái)的復(fù)合物中，有CKII的存在。逆向免疫共沉淀即在羊抗人CKII抗體沉淀下來(lái)的復(fù)合物中也檢測(cè)到了Hsp70的存在。在16HBE細(xì)胞BaP染毒和不染毒時(shí)，我們得到了相同的結(jié)果?？紤]到DNA修復(fù)是發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)的，我們進(jìn)一步用激光共聚焦技術(shù)來(lái)檢測(cè)這兩種蛋白質(zhì)的位置關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsp70和CKII在不染毒時(shí)主要分布在細(xì)胞漿，兩者大部分重合。在BaP染毒后這兩種蛋白均有一部分進(jìn)入了細(xì)胞核，并且在某些位置明顯重合

16、。而測(cè)定不同Hsp70表達(dá)水平的細(xì)胞中的CKII活性結(jié)果顯示高表達(dá)Hsp70細(xì)胞CKII活性比對(duì)照組增高（P<0.05）而低表達(dá)Hsp70細(xì)胞中CKII活性則降低。 綜上所述，本研究的結(jié)果如下： (1)確定了100μM的槲皮素為抑制16HBE細(xì)胞Hsp70表達(dá)的最佳劑量，采用含hsp70基因的cDNA重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并經(jīng)篩選建立了穩(wěn)定的Hsp70高表達(dá)細(xì)胞株。 (2)Hsp70可以增強(qiáng)BaP、BPDE所致DNA損

17、傷的修復(fù)。 (3)在B(a)P染毒恢復(fù)階段，Hsp70與維持DNA穩(wěn)定、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和移動(dòng)等多種功能的蛋白質(zhì)結(jié)合存在。 (4)Hsp70和修復(fù)密切相關(guān)的蛋白CKII在未染毒時(shí)在胞漿結(jié)合，染毒后均進(jìn)入胞核并結(jié)合存在，并且高表達(dá)的Hsp70可以增強(qiáng)CKII的活性。 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)同時(shí)使用了高表達(dá)和低表達(dá)Hsp70的細(xì)胞模型，為探討Hsp70的功能提供有力的依據(jù)，可以從正反兩個(gè)方面同時(shí)驗(yàn)證Hsp70的功能；(2)