熱休克蛋白70在苯并(a)芘所致DNA損傷修復中的作用和交互作用蛋白分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、HSPs是生物界(包括從細菌到人類)經(jīng)過長期進化仍保留下來的、對體內外不良因素起保護作用的一類蛋白質。根據(jù)HSPs在SDS-PAGE上的結果,按其分子量大小將HSPs分為如下幾個家族:大分子HSPs(≥100 KD),HSP90(81 - 99 KD),HSP70(65 - 80 KD),HSP60(55 - 64 KD),HSP40(35 - 54 KD),小分子HSPs(≤34 KD),其中最為主要和重要的是HSP70家族的Hsp7

2、0。許多研究提示了其可能的作用和功能如下:1) Hsp70保護細胞或生物免遭各種應激因素的損害,賦予它們從各種應激中恢復的能力;其中,表現(xiàn)最為明顯的是熱耐受能力的形成,即當細胞或生物接觸亞致死溫度后,表現(xiàn)對致死溫度的存活率明顯增加,并且對其他性質的致死性應激的抵抗能力也可能增強;2) Hsp70對細胞內重要遺傳物質DNA可能具有重要保護作用,且在生物生長、發(fā)育和分化過程中也起著重要作用;3) Hsp70與體內許多重要生物活性物質(如類固

3、醇、腫瘤壞死因子等)有著密切的聯(lián)系,參與體內許多調節(jié)過程;4)更重要的是,Hsp70作為分子伴侶,促進蛋白質的合成、折疊、裝配和運輸,還參與變性蛋白質的清除,這種重要功能可能與熱耐受、毒物耐受有關。 本研究通過構建高表達和低表達Hsp70兩種細胞模型,用BaP處理細胞,利用彗星實驗、宿主細胞再活化實驗來觀察Hsp70表達水平不同細胞中修復能力的差異,同時用免疫共沉淀和高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質譜檢測在DNA修復過程中和Hsp7

4、0結合存在的各種蛋白,從中篩選出可能的Hsp70作用底物。并對篩選出來的Hsp70交互作用蛋白利用免疫共沉淀、激光共聚焦和放射性自顯影進行進一步的確證,為闡述Hsp70在BaP染毒修復過程中的作用機制提供科學依據(jù)。本研究共分四部分。 第一部分、高和低表達Hsp70細胞模型的建立 對于Hsp70高表達細胞模型的建立,我們通過轉染16HBE細胞pcDNA3.1/pcDNA3.1-hsp70重組質粒,并用G418篩選穩(wěn)定的Hs

5、p70高表達細胞株(16HBE/hsp70)。用轉染空載體質粒pcDNA3.1的16HBE細胞作為轉染對照(16HBE /pcDNA)。 對于Hsp70低表達細胞模型的建立我們采用了槲皮素抑制Hsp70表達和RNA干擾技術兩種方法,通過對Hsp70的表達水平的驗證對進行兩種方法的效果進行比較。 RNA干擾(RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種研究基因功能的新方法。RNA干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源

6、mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展,被《Science》雜志評為2001年的十大科學進展之一,并名列2002年十大科學進展之首。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達,該技術已被廣泛用于探索基因的功能。運用這項技術時,可以通過轉染編碼shRNA的質粒、小干擾RNA等達到特異性降低目的基因的目的。在本研究中,采用轉染質粒的方法,在瞬時轉染48小時后,對Hsp70的表達進行檢測,從而對沉默效果

7、進行評估。 最后我們對高表達和低表達Hsp70的細胞模型進行了鑒定。利用細胞免疫熒光技術和Western-blot技術檢測各組細胞中Hsp70的表達。細胞免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)RNAi組細胞(16HBE/RNAi)的熒光強度明顯低于正常培養(yǎng)的16HBE組細胞,而高表達Hsp70組(16HBE/hsp70)細胞的胞漿內熒光強度明顯高于正常培養(yǎng)的16HBE組細胞;Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),與16HBE組相比,16HBE /RNAi

8、組Hsp70表達降低了42%(P﹤0.01),16HBE /hsp70組 Hsp70表達增加了78%(P﹤0.01)。16HBE /DMSO、16HBE/HK和16HBE /pcDNA組Hsp70的表達未見明顯變化(P>0.05)。槲皮素濃度為100μM時,對Hsp70的表達抑制了53%,稍高于沉默組,但是由于槲皮素對Hsp70的抑制是非特異性的,因而采用RNA干擾技術進行后續(xù)的相關研究。 第二部分、Hsp70在B(a)P、BP

9、DE所致DNA損傷修復中的作用 為比較B(a)P染毒后,不同Hsp70表達水平的16HBE細胞DNA修復能力的差異,本部分首先用彗星試驗檢測16μM BaP染毒16HBE細胞2h,恢復不同時間(0,2,4,8,24h),Hsp70表達水平不同的細胞對DNA損傷的修復差異。所設八組細胞Control、16HBE/HK、16HBE /RNAi、16HBE /hsp70、16HBE/pcDNA、DMSO、S9、NC(normal cul

10、tured)在處理后存活率均大于80%,并且在DMSO、S9和NC組中,存活率大于90%,均符合毒理學要求。彗星實驗結果表明隨著恢復時間的延長,各組細胞OTMs均下降,說明殘留DNA損傷的減少。在恢復前2h內,降低迅速,提示這個時間段為修復最活躍階段。在2h到8h,速度減慢。24h后,OTMs基本達到正常水平(NC,normal cultured,顯示正常培養(yǎng)時的OTMs),提示修復過程基本完成。高表達Hsp70組在修復最活躍的前2h相

11、對于對照組,OTMs值降低更迅速,說明高表達Hsp70組修復進行得更快。并且在恢復的各個時間點,高表達Hsp70組殘留的OTMs值均小于對照組,且差異有極顯著性(P<0.01)。而在低表達Hsp70組中,在修復最活躍的前2h內OTMs的降低速度和對照組相比明顯減慢(P<0.01)。由此可見,在修復最活躍的前2h的結果提示,Hsp70參與了BaP造成的DNA損傷的修復過程,它可以促進細胞對這種損傷的修復。這可能與作為分子伴侶的Hsp70可

12、以幫助變性受損的蛋白質復性或降解有關,高表達的Hsp70增強了分子伴侶作用,保持了蛋白質的穩(wěn)態(tài),減輕了細胞的損傷。 第三部分、BaP作用下Hsp70交互作用蛋白的鑒定 在本部分中,16μM B(a)P染毒16HBE細胞2h恢復4h后,運用免疫共沉淀把在修復過程中和Hsp70有交互作用的所有蛋白沉淀下來,并對其進行高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質譜分析(HPLC ESI MS/MS)。樣本中總共有730種蛋白被檢測,我們對其中含量

13、較高的84種蛋白進行了分析,根據(jù)swiss-prot database蛋白質數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org)提供了蛋白質的各種說明,包括蛋白名稱、起源、功能、交互作用、結果等,把這84種蛋白分成了13個功能組,分別是細胞結構和移動(14%)、蛋白質代謝和修飾(12%)、DNA穩(wěn)定性(6%)、細胞內和細胞間信號(7%)、細胞分化和增殖(74%)、蛋白交互作用(6%)、凋亡(5%)、核酸代謝(5%)、生理功能的執(zhí)行(6%

14、),細胞損傷保護(2%)、能量代謝(1%),未知部分和其他部分(27%)。從結果可見,在修復過程中,Hsp70不僅和參與生理功能的蛋白質有交互作用,而且和維持DNA穩(wěn)定、抵抗細胞損傷的蛋白質之間也有交互作用,Hsp70可能是通過復雜的功能網(wǎng)絡參與BaP所致?lián)p傷的修復,這為進一步闡述Hsp70在修復過程中所發(fā)揮的多重功能提供了線索。 第四部分、BaP作用下Hsp70和CKII的交互作用 Hsp70和CKII免疫共沉淀結果顯

15、示,在兔抗人Hsp70抗體沉淀下來的復合物中,有CKII的存在。逆向免疫共沉淀即在羊抗人CKII抗體沉淀下來的復合物中也檢測到了Hsp70的存在。在16HBE細胞BaP染毒和不染毒時,我們得到了相同的結果。考慮到DNA修復是發(fā)生在細胞核內的,我們進一步用激光共聚焦技術來檢測這兩種蛋白質的位置關系,結果發(fā)現(xiàn)Hsp70和CKII在不染毒時主要分布在細胞漿,兩者大部分重合。在BaP染毒后這兩種蛋白均有一部分進入了細胞核,并且在某些位置明顯重合

16、。而測定不同Hsp70表達水平的細胞中的CKII活性結果顯示高表達Hsp70細胞CKII活性比對照組增高(P<0.05)而低表達Hsp70細胞中CKII活性則降低。 綜上所述,本研究的結果如下: (1)確定了100μM的槲皮素為抑制16HBE細胞Hsp70表達的最佳劑量,采用含hsp70基因的cDNA重組質粒進行細胞轉染并經(jīng)篩選建立了穩(wěn)定的Hsp70高表達細胞株。 (2)Hsp70可以增強BaP、BPDE所致DNA損

17、傷的修復。 (3)在B(a)P染毒恢復階段,Hsp70與維持DNA穩(wěn)定、細胞結構和移動等多種功能的蛋白質結合存在。 (4)Hsp70和修復密切相關的蛋白CKII在未染毒時在胞漿結合,染毒后均進入胞核并結合存在,并且高表達的Hsp70可以增強CKII的活性。 本研究的創(chuàng)新之處在于:(1)同時使用了高表達和低表達Hsp70的細胞模型,為探討Hsp70的功能提供有力的依據(jù),可以從正反兩個方面同時驗證Hsp70的功能;(2)

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