慢性充血性心衰實驗大鼠的認知功能變化及大腦海馬區(qū)葡萄糖-脂肪-氨基酸代謝及神經遞質類基因表達規(guī)律的研究.pdf

1、本研究從中醫(yī)學整體觀“心主血脈、心主神明”的思想出發(fā)，研究慢性心衰心氣虛證時大腦的認知功能變化。 本研究工作首先從文獻的角度，對臨床上充血性心衰(CHF)伴隨認知功能的變化進行了綜述。在此基礎上，利用大鼠冠狀動脈前降支結扎后出現(xiàn)CHF以及伴隨的血瘀、心氣虛及心陽虛的中醫(yī)證型演化(前期基礎)模型，從Morris實驗對空間學習記憶研究的角度，評價了大鼠心梗后CHF不同時期的空間學習記憶能力。此外，利用基因表達芯片，進一步研究了該狀態(tài)

2、下大腦海馬區(qū)和皮質區(qū)的基因變化規(guī)律?；蛐酒瑪?shù)據(jù)的前期分析采用GeneSringTM分析軟件，基因背景信息來源于GenBankNucleotide、PubMed、RatMap、LocusLink、SWISS-PROT和RGDGENEBANK(大鼠基因數(shù)據(jù)庫)等相關公共數(shù)據(jù)庫。 本研究的主要結論： 1.大鼠在結扎左前降支冠狀動脈后于術后10天、30天、60天、90天(70天時連續(xù)給藥L-NNA共22天)和終末期(測定心功能

3、后2天內死亡)時分別測定其血流動力學指標，結果表明術后各個時期大鼠均出現(xiàn)不同程度的CHF表現(xiàn)。心梗術后10天大鼠的CI值為(162.9±36.0)ml/min/kg(n=8)；心梗術后30天和60天時，大鼠CI值分別為(180.1±56.8)ml/min/kg(n=10)和(171.1±38.7)ml/min/kg(n=9)；心梗術后90天時，其CI值為(131.9±17.1)ml/min/kg(n=10)；CHF終末期的大鼠CI值最低

4、，為(110.7±19.2)ml/min/kg(n=3)。 2.Morris水迷宮實驗表明，正常組大鼠、術后30天和術后60天三組大鼠的空間學習和記憶能力，沒有發(fā)生明顯變化。術后10天、術后90天和CHF終末期大鼠的空間學習和記憶功能發(fā)生了明顯變化。各組陽性結果為：①術后10天組：術后10天大鼠Morris學習記憶穩(wěn)定期(后8組次訓練)平均對數(shù)潛伏期，手術組為(0.971±0.467)秒(n=128)，假手術組為(0.819±0

5、.355)秒(n=112)，手術組明顯比假手術組長；搜索策略，手術組的認知較好率為(96/128，75.0％)，假手術組為(100/112，89.3％)，兩組相比X2=8.142，P＜0.005；②終末期組：大鼠全部9組次訓練的平均對數(shù)潛伏期，終末期為(1.606±0.479)秒(n=80)，終末對照為(1.165±0.469)秒(n=80)，終末期明顯比對照組長；搜索策略，終末期的認知較好率為(13/70，18.6％)，終末對照的認知

6、較好率為(32/70，45.7％)，兩組相比X2=11.82，P＜0.005；③90天組(術后70天后連續(xù)給藥L-NNA共22天，分為L-NNA組和L-NNA對照組)：L-NNA組全部9組次訓練的平均對數(shù)潛伏期為(1.248±0.508)秒(n=180)，L-NNA對照組的平均對數(shù)潛伏期為(1.500±0.520)秒(n=162)，L-NNA組比L-NNA對照組的平均對數(shù)潛伏期明顯縮短，差異顯著；搜索策略方面，L-NNA組總的認知能力較

7、好率為(99/180，55.0％)，L-NNA對照組的認知能力較好率為(50/162，30.9％)，兩組間比較，X2=11.82，P＜0.005。 3.本實驗共使用13張R40s芯片，其中每張芯片總基因數(shù)為4096條，未知基因789條，EST為2670條，已知功能核苷酸片段為637條。本研究采用重復基因芯片的方法進行芯片假陽性率的控制，即分析的基因為兩張(及以上)芯片同時為陽性的基因(共43條)，將只有一個有效數(shù)據(jù)的陽性基因或只

8、有一個數(shù)據(jù)為陽性的基因(共69條)，從總的陽性基因(共112條)中剔除。其中，一張芯片使用的總RNA取材自1只大鼠，另一張芯片使用的總RNA取材自同組的2只大鼠合并后的總RNA。芯片實驗共分三組：術后10天組、術后60大組和術后90天組。 4.大鼠海馬和皮質區(qū)的基因芯片陽性數(shù)據(jù)結果：已知的637條基因中，術后10天組海馬區(qū)陽性表達基因有24條，皮質區(qū)1條；術后60天組海馬區(qū)陽性表達基因有14條；術后90天組海馬區(qū)陽性表達基因有4

9、條。在三組中的所有陽性基因，除了術后60天有2條基因表現(xiàn)為上調，其余均表現(xiàn)為下調； 5.基因芯片分析結果：①心梗CHF形成期(術后10天組)海馬區(qū)，存在較明顯的葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝類基因的陽性表達：CHF后10天糖/能量代謝類基因變化主要是丙酮酸激酶3(NM053297)基因，這條基因所控制的蛋白質是在大腦糖/能量代謝過程中起關鍵作用的酶，是糖酵解過程中重要的限速酶，該基因的表達下調，提示CHF后10天海馬區(qū)的糖/能量代謝

10、出現(xiàn)障礙；脂肪酸代謝類基因的陽性表達有催化脂肪酸氧化后生成酮體過程的最后一步反應酶——3-羥3-甲基輔酶A裂解酶基因(NM_024386)，其表達在術后10天出現(xiàn)下調。脂肪酸β氧化生成的乙酰輔酶A在進入酮體生成途徑，再進入三羧酸循環(huán)，為大腦進行供能過程中，3-羥3-甲基輔酶A裂解酶的基因控制該反應的最后一步，因此該條基因的表達下調，提示大腦的脂肪酸β氧化后后成酮體生成過程出現(xiàn)障礙；在氨基酸代謝方面，谷氨酸草酰乙酸轉氨酶2基因(NM013

11、177)在術后10天表達下調。該基因在氨基酸的轉氨基作用中起重要作用，尤其是影響谷氨酸和天冬氨酸的代謝，而這兩個氨基酸同時還是大腦重要的興奮性神經遞質；②心梗CHF形成期(術后10天組)海馬區(qū)，存在較明顯的神經遞質類基因的陽性表達：心梗CHF形成期(術后10天組)海馬區(qū)，除了影響谷氨酸和天冬氨酸代謝的谷氨酸草酰乙酸轉氨酶2基因(NM013177)表達下調外，乙酰膽堿類代謝基因也出現(xiàn)了變化，包括煙堿ε多肽乙酰膽堿受體基因(NM017194

12、)表達下調和與乙酰膽堿釋放有關的ATP敏感鉀通道Endosulfine蛋白基因(NM021842)表達下調，說明了CHF時的認知功能變化與大腦的神經遞質變化關系密切；③心梗后CHF形成期海馬區(qū)神經鞘脂代謝、細胞骨架及神經細胞信號轉導、離子運輸、脂質代謝等的變化，一定程度上也揭示了這些基因與太腦認知功能障礙的關系。 6.本研究是在王碩仁研究員對CHF大量的前期工作基礎上進行的，因此對于中醫(yī)證型的研究未作重點討論。但本研究從實驗角度