易損斑塊動物模型的構建和基因治療穩(wěn)定易損斑塊的實驗研究.pdf

1、背景 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)易損斑塊破裂是急性冠脈綜合征(Acutecoronary syndrome，ACS)的主要發(fā)病機制。斑塊的易損性是決定斑塊破裂的內在因素，易損斑塊的特征主要包括薄的纖維帽、大的脂質核和大量炎癥細胞的積聚。斑塊的應力．應變狀態(tài)改變是觸發(fā)斑塊破裂的外部因素。 易損斑塊的早期識別和干預對于急性心血管事件的預防具有十分重要的意義。研究動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的因素，促使易損

2、斑塊向穩(wěn)定方向轉變，是預防心腦血管事件的重要方法。易損斑塊發(fā)生發(fā)展機制和預防、治療等一系列研究均依賴于一個理想的動物模型，然而，目前的動物模型仍不夠完善，主要存在以下幾點問題：①斑塊破裂的發(fā)生與人類病變的發(fā)展情況不夠一致；②斑塊內缺乏炎癥反應；③斑塊自發(fā)破裂率低，破裂處富含血小板和纖維蛋白的血栓少見。 另一方面，由于儀器功能的限制，以往對小動物模型易損斑塊的檢測多集中于后期的組織學分析。晚近，高分辨率顯微超聲技術被用于追蹤觀察a

3、poE基因敲除(apoE-/-)小鼠AS病變的發(fā)展。是否該技術亦可用于早期識別apoE-/-小鼠體內的易損斑塊?目前國內外尚無相關報道。 針對上述問題，本研究在apoE-/-小鼠高脂飲食的基礎上，給予脂多糖和精神應激刺激，擬在通過多因素的聯合干預構建斑塊自發(fā)破裂率高的AS易損斑塊動物模型，闡述多因素聯合干預致斑塊易損的機制。同時，應用顯微超聲技術檢測模型在體的易損斑塊，評價顯微超聲在apoE-/-小鼠易損斑塊識別中的應用價值。

4、 目的 1.通過多重因素聯合干預構建高度模擬人類AS病變的易損斑塊動物模型。 2.闡述多重因素聯合干預促進斑塊破裂的病理生理學機制和分子生物學機制。 3.評價顯微超聲在apoE-/-小鼠易損斑塊識別中的應用價值。 方法 1.動物實驗：108只10-12周齡的雄性apoE-/-小鼠實驗全程高脂飲食(含0.25﹪膽固醇和15﹪脂肪)喂養(yǎng)。實驗動物隨機分為4組：應激組，脂多糖組，脂多糖/應激組和對

5、照組，每組27只。全部實驗鼠均于實驗初行左頸總動脈套管(縮窄性硅膠管)術以誘發(fā)AS病變。脂多糖組于頸動脈套管手術4周后給予脂多糖腹腔注射(1mg/kg，每周2次，持續(xù)8周)；應激組于頸動脈套管手術8周后給予精神應激刺激(足底電擊和噪音刺激，每天1小時，持續(xù)4周)；應激/脂多糖組聯合給予應激和脂多糖刺激；對照組不給任何刺激。 2.血流動力學評價：實驗末期通過鼠尾測壓儀測量實驗鼠的收縮壓、舒張壓和心率：通過顯微超聲儀測量頸動脈斑塊部

6、位最大血流速度(Vmax)和左室射血分數(LVEF)，評價機體全身和局部的血流動力學狀態(tài)。 3.易損斑塊的超聲影像學形態(tài)特征：應用顯微超聲技術測量斑塊長度、外彈力膜面積(EEMA)、斑塊面積、內膜.中層厚度(IMT)和斑塊近端的Vmax。計算斑塊的偏心指數(EI)和重構指數(RI)。 4.血清去甲腎上腺素(NE)和生化指標檢測：末次應激實驗結束后，即刻予全部動物眼球后采血。測定血清中NE、高敏C.反應蛋白(hsCRP)、

7、血脂和血漿纖維蛋白原濃度。 5.病理學檢測：頸動脈斑塊組織學切片分別行蘇木素.伊紅染色、Masson三染、天朗猩紅染色、Verhoeff染色、油紅O染色、Perl's染色(含鐵血黃素染色)，并進行免疫組織化學染色觀察巨噬細胞(MOMA.2)、平滑肌肌動蛋白(a-SM-actin)的局部表達。測量斑塊面積、血管面積和纖維帽厚度；測量膠原、脂質、平滑肌細胞、巨噬細胞免疫組化陽性染色面積，并計算它們占斑塊面積的比例。統計斑塊的破裂率，

8、計算易損指數。易損指數=(巨噬細胞+脂質)面積陽性百分比/(平滑肌細胞+膠原)面積陽性百分比。 6.實時定量RT-PCR：實時熒光定量RT-PCR反應檢測斑塊內IL-6、IL-18、TNF-α、MCP-1、MMP9、MMP12 mRNA的表達水平。結果1.動物的基本特征：應激/脂多糖組有1只動物于首次注射脂多糖后死亡，其余動物全部完成實驗。動物各組間體重無明顯差異。 2.血流動力學評價：應激顯著增加收縮壓、舒張壓、心率、

9、Vmax和LVEF(均P<0.001，FactorialANOVA)。應激和應激/脂多糖組收縮壓、舒張壓、心率、Vmax和LVEF顯著高于脂多糖組(均P<0.001)和對照組(均P<0.001)。 3.As易損斑塊影像學特征：顯微超聲測量的斑塊面積(r=0.606，P=0.004)、IMT(r=0.777，P<0.001)、偏心指數(r=0.784，P<0.001)和重構指數(r=0.854，P<0.001)與組織學檢測結果有顯

10、著的相關性。破裂斑塊的平均IMT(0.344±0.09比0.224±0.07 mm.P<0.001)和EI(0.72±0.15比0.4±0.18，P<0.001)均顯著高于非破裂組。71.4﹪的破裂斑塊呈現明顯的血管正性重構，破裂組的平均重構指數顯著高于非破裂組(1.1±0.15比1.03±0.07，P=-0.002)。破裂斑塊組近端的Vmax顯著高于非破裂斑塊組(1.22 4±0.34比0.79 4±0.25 m/s，P<0.001)

11、。Logistic回歸分析結果顯示斑塊IMT和斑塊近端的Vmax是預測斑塊破裂的獨立因素，其OR值分別為1.017(95﹪CI：1.004-1.030)和1.005(95﹪CI：1.001-1.009)。 4.血液NE和生化檢測：應激顯著升高血清NE水平(P<0.001，Factorial ANOVA)。應激組和應激/脂多糖組的NE濃度明顯高于脂多糖組(均P<0.001)和對照組(均P<0.001)。應激和脂多糖均明顯導致血清h

12、sCRP濃度升高(均P<0.001，Factorial ANOVA)，并且應激與脂多糖聯合作用具有協同作用(P=0.003，Factorial ANOVA)，聯合處理組的hsCRP水平顯著高于應激組(P<0.001)和脂多糖組(P<0.001)。各組間總膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇和低密度膽固醇濃度均沒有統計學差異。應激和脂多糖均顯著增加血漿纖維蛋白原濃度(均P<0.001，Factorial ANOVA)，應激/脂多糖組的纖維蛋白原

13、濃度顯著高于應激組(P<0.001)和脂多糖組(P<0.001)。 5.應激和脂多糖聯合刺激產生的AS易損斑塊表型：應激和應激/脂多糖組斑塊破裂率均顯著高于對照組(P=0.036，0.036)。應激/脂多糖組中2例發(fā)生斑塊破裂伴腔內血栓，1例發(fā)生斑塊內出血。應激組有1例斑塊肩部斷裂伴出血。各組間斑塊面積沒有統計學差異。應激和脂多糖刺激均顯著降低斑塊纖維帽厚度(均P<0.001，Factorial ANOVA)，降低帽/核比值(均

14、P<0.001，FaetodalANOVA)，并且聯合應用具有協同效應(P=0.048，0.019，Factorial ANOVA)。應激/脂多糖組的膠原含量顯著減少(均P<0.01)，脂質含量顯著增加(均P<0.01)，巨噬細胞明顯增多(均P<0.05)。應激和脂多糖聯合應用對巨噬細胞和膠原含量有顯著的協同效應（P=0.013，0.043，Factorial ANOVA)。各組間斑塊內平滑肌細胞含量沒有統計學差異。應激/脂多糖組斑塊的

15、易損指數為2.53±0.54，顯著高于其它各組(對照組：0.85±0.07，P<0.001；脂多糖組：1.81±0.14，P=0.001；應激組：1.78±0.12，P=0.001)。 6.斑塊內基因的表達：應激顯著增加斑塊內IL-6(P=0.001)、IL-18(P=0.01)、TNF-α[(P=0.044)、ICAM-1(P=0.018)、MCP-l(P<0.001)、TF(P=-0.014)、MMP9(P=0.007)和MMP12

16、(P=0.039)的表達；脂多糖顯著增加斑塊內IL-6(P=0.030)、ICAM-1(P=0.022)、TF(P=0.049)和MCP-1(P=-0.017)的表達。應激/脂多糖組斑塊內各炎性因子和MMPs的表達量均顯著高于對照組(均P<0.05)，其中MCP-1和MMP9的表達明顯高于脂多糖組(P=0.004，0.023)。 結論 1.在高脂喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠的頸動脈，先通過套置縮窄性套管的方法誘發(fā)AS斑塊形成

17、，再通過精神應激聯合脂多糖刺激的方法促進斑塊發(fā)生易損性改變，并自發(fā)破裂。這種多因素聯合干預導致的斑塊破裂模型，其自發(fā)破裂率高，并伴發(fā)血栓形成和斑塊內出血，與人類病變極為相似。 2.機體的高血流動力學反應、高凝狀態(tài)和炎癥反應增強是促進斑塊自發(fā)破裂，并伴發(fā)血栓形成的主要機制。應激激活交感神經系統，血液NE濃度升高，血流動力學反應增強，使斑塊的應力.應變狀態(tài)發(fā)生改變。在應激和脂多糖聯合作用下血液纖維蛋白原升高，血液高凝；血液中的hsC